基于反向遗传学技术获取具有精确末端的EV-A71

作     者：王三元 王誉雅 熊庆 陶淇惠 彭宜红 WANG San-yuan;WANG Yu-ya;XIONG Qing;TAO Qi-hui;PENG Yi-hong

作者机构：北京大学医学部基础医学院病原生物学系北京100083 

基　　金：国家自然科学基金(81772184) 北京市自然科学基金(19G10290) 

出 版 物：《微生物学免疫学进展》 (Progress In Microbiology and Immunology)

年 卷 期：2020年第48卷第2期

页      码：1-7页

摘      要：目的基于反向遗传学技术,设计可获取具有精确末端的肠道病毒A71(enterovirus A71, EV-A71)的方法,并在病毒感染能力研究和抗病毒药物筛选中进行应用。方法利用同源重组方法,在病毒基因组5′末端,引入具有顺式酶切活性的锤头状核酶(cis-active hammerhead ribozyme)序列;在病毒3′末端的poly(A)尾后,引入限制性核酸内切酶NsiⅠ酶切位点(ATGCA↓T),构建含有EV-A71全长感染性克隆的质粒(pBR322-EV-A71)。pBR322-EV-A71经体外转录获得EV-A71感染性RNA,用该RNA转染横纹肌肉瘤细胞(rhabdomyo-sarcoma cells, RD),以获取具有精确末端的EV-A71颗粒。通过检测病毒RNA拷贝数、病毒蛋白的表达量等指标,验证拯救病毒的感染能力和抗病毒药物的抑制作用。结果 pBR322-EV-A71经体外转录所得RNA,在转染进入RD细胞后,观察到细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)并检测到病毒负链RNA,表明成功合成了EV-A71颗粒;拯救病毒颗粒在连续传代过程中,病毒增殖能力得以逐步提升,第4代病毒(R4 EV-A71)的感染能力强于第1、2、3代病毒(R1、R2、R3 EV-A71)(P0.05);U0126和sorafenib两种ERK通路抑制剂可以有效抑制R4 EV-A71的增殖(P<0.001),且R4 EV-A71与wt EV-A71表现出同等程度的抑制作用。结论 pBR322-EV-A71可拯救出具有精确末端的EV-A71病毒颗粒,且其子代病毒可代替wt EV-A71进行病毒感染能力的评价和抗病毒药物的筛选。

主 题 词：肠道病毒A71 反向遗传学技术 同源重组 

学科分类：1004[医学-公共卫生预防医学类] 100401[100401] 10[医学] 

D　O　I：10.13309/j.cnki.pmi.2020.02.001

馆 藏 号：203923034...