靶向人端粒酶反转录酶RNA干扰载体质粒的构建与筛选

作     者：陈丹 黄洪章 潘朝斌 王建广 张彬 钱永 

作者机构：中山大学附属第一医院口腔颌面外科广东广州510080 中山大学光华口腔医学院口腔颌面外科广东广州510055 中山大学附属第二医院口腔颌面外科广东广州510120 

基　　金：国家自然科学基金(30672333) 广东省自然科学基金(06104607)~~ 

出 版 物：《中国口腔颌面外科杂志》 (China Journal of Oral and Maxillofacial Surgery)

年 卷 期：2008年第6卷第6期

页      码：435-443页

摘      要：目的:设计靶向人端粒酶反转录酶的RNAi序列,构建shRNA表达载体质粒和hTERT真核表达质粒,采用共转染工具细胞筛选出有效靶点。方法:首先以EASYTMsiRNA软件针对hTERT设计5个靶点siRNA序列和1条通用阴性对照序列,合成shRNA oligo表达框架,将其分别连接至经酶切消化的载体质粒、pGCsi-U6/Neo/GFP、pGCL-GFP,重组质粒转化DH5α,阳性克隆进行PCR与测序鉴定;然后从cDNA文库中利用PCR钓取hTERT基因片段,与表达载体pEGFP-C1分别进行双酶切、纯化及定向连接、重组、转化,阳性克隆行PCR与测序鉴定,荧光镜检GFP表达;最后上述2个质粒系统共转染293T细胞,Western印迹检测hTERT蛋白表达水平,筛选最有效序列。应用SPSS16.0软件包对所得数据进行单因素方差分析。结果:BLAST检索5条hTERT siRNA序列均能100%命中,且不与其他基因同源;PCR鉴定及阳性克隆测序验证shRNA oligo与载体质粒成功连接、重组。hTERT基因PCR钓取片段产物大小1.4 Kp,经酶切与质粒连接,形成pEGFP-C1-hTERT表达载体,阳性克隆PCR、测序鉴定确定成功重组;转染293T细胞48h时荧光镜下可观察到GFP标记的hTERT融合蛋白。hTERT表达质粒和shRNA载体质粒共转染293T细胞,48h时Western印迹检测结果显示:实验各组hTERT蛋白量均有不同程度减少,而内参对照β-actin和GAPDH无明显变化。经β-actin校正,得到各组hTERT蛋白相对表达量:KD No.1-5实验组与NC组相比,hTERT基因表达均得到不同程度的敲减(54.61%～76.84%,P<0.05),其中No.4敲减效能最高。结论:5条RNAi设计序列均可有效、特异性地沉默hTERT基因的转录和表达水平,其中以5’-GCAAGTTGCAAAGCATTGGAA-3’敲减效能最优;构建外源基因的过表达载体质粒转染工具细胞,可作为RNAi敲减效率筛选的验绩标靶。

主 题 词：RNA干扰 人端粒酶反转录酶 质粒构建 基因转染 

学科分类：1001[医学-基础医学] 10[医学] 

馆 藏 号：203932838...