针对核干细胞因子腺病毒干扰载体构建与干扰作用观察

作     者：韩崇旭 孙艳 许文荣 张锡然 HAN Chong-xu;SUN Yan;XU Wen-rong;ZHANG Xi-ran

作者机构：江苏省苏北人民医院·扬州大学临床医学院临床医学检测中心江苏扬州225001 江苏省苏北人民医院·扬州大学生殖医学中心江苏扬州225001 江苏大学基础医学与医学技术学院检验医学研究所江苏镇江212013 南京师范大学生命科学院分子细胞生物学研究所江苏南京210023 

基　　金：江苏省自然科学基金(BK2007072) 江苏省卫生厅“科教兴卫工程”医学重点学科“实验诊断学”开放性课题(XK200723/WKF0809) 江苏省苏北人民医院院内基金(yzucms201039) 

出 版 物：《中华肿瘤防治杂志》 (Chinese Journal of Cancer Prevention and Treatment)

年 卷 期：2015年第22卷第8期

页      码：588-594页

摘      要：目的构建针对核干细胞因子(Nucleostemin)基因寂寞的RNA干扰腺病毒载体,观察其干扰作用。方法根据克隆的全长Nucleostemin基因(1 650bp,GenBank接受序号:AY825265)设计RNA干扰反向重复序列,采用分子生物学组装腺病毒载体,制备高效价RNAi重组腺病毒。实验分为Backbone-P1P2重组腺病毒感染组(P1P2干扰组)、Backbone-P3P4重组腺病毒感染组(P3P4干扰组)、Backbone空质粒病毒感染对照组(B组)和无病毒感染对照组。不同剂量腺病毒液RNAi(分别为60、30、15和7.5μL)转染F6细胞及U937细胞,采用蛋白质印迹法检测F6细胞及U937细胞中核干细胞因子的蛋白表达水平,采用实时荧光定量PCR(QPCR)检测U937细胞中核干细胞因子的mRNA表达水平。计数法绘制细胞生长曲线,判定细胞活力;流式细胞术检测细胞周期变化。结果靶向核干细胞因子基因的腺病毒RNA干扰载体(Backbone-P1P2,Backbone-P3P4)被成功构建。蛋白质印迹法检测结果显示,F6细胞内不同梯度浓度腺病毒RNA干扰后,核干细胞因子表达量分别为1.23、4.48、5.03和5.75,随P3P4片段RNA干扰浓度梯度下降而核干细胞因子表达量呈上升趋势。P1P2干扰组蛋白水平为0.219±0.051,与空质粒转染对照组的2.174±0.196比较明显降低,F=279.4,P<0.001;P3P4干扰组蛋白水平为0.0164±0.003,与空质粒转染对照组比较明显降低,F=363.4,P<0.001。P1P2干扰组基因表达水平为1.585±0.20,与空质粒转染对照组的3.932±0.271比较明显降低,F=145.9,P<0.001;P3P4干扰组基因表达水平为1.328±0.251,与空质粒转染对照组比较明显降低,F=149.9,P<0.001。细胞周期实验发现,核干细胞因子干扰后,P1P2腺病毒RNA干扰组为44.89±4.04,与空质粒转染对照组的54.74±3.28对比减低,F=10.75,P=0.031;P3P4干扰组为45.00±3.82,与空质粒转染对照组对比减低,F=11.23,P=0.029;S期+G2M期细胞P1P2干扰组为55.11±2.81,与空质粒转染对照组的45.26±1.72对比升高,F=26.82,P=0.007;P3P4干扰组为55.00±2.64,与空质粒转染对照组相比明显升高,F=28.67,P=0.006。表明核干细胞因子在细胞周期中阻碍G2/M检验点通过。结论成功构建针对核干细胞因子基因沉默的RNA干扰腺病毒载体,该病毒载体可特异有效的沉默下调核干细胞因子基因的表达,为今后研究核干细胞因子功能奠定了基础。

主 题 词：核干细胞因子 RNA干扰 腺病毒 表达载体 基因表达 细胞周期 细胞增殖 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 100214[100214] 10[医学] 

D　O　I：10.16073/j.cnki.cjcpt.2015.08.005

馆 藏 号：203941624...