基于TaqMan-MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测方法

作     者：马来 童桂香 韦信贤 曾德乾 熊建华 王瑞 黄光华 江林源 MA Lai;TONG Gui-xiang;WEI Xin-xian;ZENG De-qian;XIONG Jian-hua;WANG Rui;HUANG Guang-hua;JIANG Lin-yuan

作者机构：北海南方海洋生态养殖有限公司广西北海536000 广西水产科学研究院/广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室广西南宁530021 南宁市武鸣区陆斡镇水产畜牧兽医站广西南宁530111 广西柳州种畜场广西柳州545003 

基　　金：广西创新驱动发展专项(桂科AA17204081-4,桂科AA17204095-1,桂科AA17204095-5) 广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室自主研究项目(19-A-03-03) 

出 版 物：《西南农业学报》 (Southwest China Journal of Agricultural Sciences)

年 卷 期：2020年第33卷第6期

页      码：1319-1326页

摘      要：【目的】基于TaqMan-MGB探针建立虾肝肠胞虫(EHP)荧光定量PCR检测方法,为EHP的快速定量检测及实时监测提供技术手段。【方法】以EHP的SSU rDNA基因为检测靶基因,在其保守区设计特异性的扩增引物和TaqMan-MGB探针,将PCR扩增目标片段克隆至pMD18-T载体构建重组质粒pMD18-T-SSU^EHP(标准品),以标准品DNA为模板优化反应体系,建立检测EHP的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR;以10倍梯度稀释的标准品DNA为模板构建扩增标准曲线,并进行特异性、敏感性、重复性及临床应用试验。【结果】制备的重组质粒pMD18-T-SSU^EHP DNA稳定性好,可满足作为标准品和阳性对照的要求;标准品(pMD18-T-SSU^EHP)起始模板范围为2.0×10^1~2.0×10^9拷贝/反应时,建立的标准曲线线性关系良好,对应的线性回归方程为y=-3.232×lg(x)+39.51。基于TaqMan-MGB探针建立的EHP荧光定量PCR对标准品的检测灵敏度可达20拷贝/反应,对临床虾样品EHP的检测灵敏度约10拷贝/mg,较农业农村部推荐的套式PCR约提高10倍;对虾类其他常见病原均无扩增反应,其组内和组间变异系数分别为0.26%~0.72%和0.56%~0.92%,整个检测过程可在1 h内完成。采用建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR与套式PCR同时对276份临床虾样品进行检测比较,发现两种方法的符合率为96.7%,检测低拷贝数虾样品时前者具有更高的灵敏度;2018和2019年广西虾样品的EHP阳性检出率分别为16.2%和30.6%。【结论】基于TaqMan-MGB探针建立的EHP荧光定量PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量范围宽及简单快速等优点,适用于虾类样品的EHP定量检测,可为EHP实时监测及EHPD快速诊断提供一种新的技术手段。

主 题 词：虾肝肠胞虫 SSU rDNA基因 TaqMan-MGB探针 荧光定量PCR 

学科分类：0906[农学-水产类] 09[农学] 

D　O　I：10.16213/j.cnki.scjas.2020.6.034

馆 藏 号：203956293...