温度诱导Targetron系统用于大肠杆菌高效基因失活

作     者：赵行行 程玉梅 吴昌学 任玮 饶凤琴 周倩 崔古贞 齐晓岚 洪伟 Xingxing Zhao;Yumei Cheng;Changxue Wu;Wei Ren;Fengqin Rao;Qian Zhou;Guzhen Cui;Xiaolan Qi;Wei Hong

作者机构：贵州医科大学地方病与少数民族疾病教育部重点实验室贵州贵阳550004 贵州医科大学附属医院ICU贵州贵阳550004 贵州医科大学免疫学教研室贵州贵阳550004 贵州医科大学微生物学教研室贵州贵阳550025 

基　　金：国家自然科学基金(Nos.31560318,31760318) 贵州省自然科学基金(Nos.1Z067,1441,1132,5779-17)资助 

出 版 物：《生物工程学报》 (Chinese Journal of Biotechnology)

年 卷 期：2020年第36卷第8期

页      码：1659-1671页

摘      要：构建基于Te I3c/4c嗜热二型内含子的温度诱导Targetron基因失活系统(Thermotargetron),并应用于中温微生物基因编辑。在大肠杆菌HMS174(DE3)基因组中,选择Subunitofflagellum基因(fliC)和C4dicarboxylate orotate:H+symporter基因(dctA)为靶基因。根据Te I3c/4c DNA识别规则,在fliC和dctA基因中选择fliC489a、fliC828s、fliC1038s和dctA2a位点为基因打靶位点。使用重叠延伸PCR方法,基于pHK-TT1A质粒构建打靶载体。打靶载体转化HMS174菌株,对数期转化子培养液48℃热激1h后涂布于氯霉素抗性LB平板上。使用菌落PCR和DNA测序检测突变株并计算基因失活效率。获得突变株后,通过琼脂穿刺和碳源代谢实验,鉴定ΔfliC、ΔdctA突变株表型变化。菌落PCR测序结果表明,Te I3c/4c插入到fliC和dctA基因设计位点,且打靶效率高达100%。突变株表型验证实验表明,ΔfliC突变株运动能力显著下降,ΔdctA突变株苹果酸代谢能力缺失。综上所述,文中建立了一套适用于嗜中温微生物的温度诱导型、高效基因失活系统,该系统可通过控制宿主菌在48℃保温时间实现高效、靶向、精准基因失活。

主 题 词：嗜热targetron Ⅱ型内含子 温度诱导 基因失活 大肠杆菌 fliC dctA 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 

核心收录：

D　O　I：10.13345/j.cjb.190547

馆 藏 号：203968535...