FGFR3真核表达载体的构建及其在人白血病细胞系K562中的表达

作     者：许会静 杜彤华 孙艳 李校堃 肖业臣 XU Hui-jing;DU Tong-hua;SUN Yan;LI Xiao-kun;XIAO Ye-chen

作者机构：吉林大学基础医学院生物化学教研室吉林长春130021 吉林医药学院检验学院临床生物化学检验教研室吉林吉林132013 吉林大学第二医院肿瘤血液内科吉林长春130041 

基　　金：国家自然科学基金资助课题(81370640) 吉林省科技厅重点科技攻关项目资助课题(20130206003YY) 吉林省科技厅医药产业发展专项资金资助课题(20130727041YY) 

出 版 物：《吉林大学学报（医学版）》 (Journal of Jilin University：Medicine Edition)

年 卷 期：2014年第40卷第3期

页      码：465-470页

摘      要：目的:构建成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)真核表达载体MSCV/puro-fgfr3-WT和MSCV/purofgfr3-DN,并检测FGFR3蛋白在人白血病细胞系K562中的表达。方法:通过PCR法获得FGFR3全长基因(fgfr3-WT)和截短失活型的FGFR3(fgfr3-DN),经双酶切后与真核表达载体MSCV/puro连接,构建MSCV/puro-fgfr3-WT和MSCV/puro-fgfr3-DN重组表达质粒。经PCR、双酶切及测序鉴定正确后,脂质体介导转染至人白血病细胞系K562中,经puromycin抗性筛选后,Western blotting法和流式细胞术检测细胞中FGFR3蛋白的表达。结果:PCR法鉴定MSCV/puro-fgfr3-WT和MSCV/puro-fgfr3-DN重组质粒,2个质粒分别扩增出2 400bp的fgfr3-WT全长基因片段和1 200bp的fgfr3-DN截短型片段,表明成功扩增fgfr3-WT全长基因和1 200bp的fgfr3-DN基因;双酶切MSCV/puro-fgfr3-WT重组质粒,获得2 400bp的目的基因片段;测序显示,fgfr3-WT片段大小为2 400bp,Blast对比分析表明测序结果与GenBank中的FGFR3序列完全一致。fgfr3-DN片段大小与预先设计的序列完全一致,表明成功构建野生型FGFR3和突变失活型FGFR3真核表达载体;Western blotting检测,与对照组(K562-MSCV)比较,MSCV/puro-fgfr3-WT转染组(K562-WT)FGFR3蛋白表达水平增加,表达水平是对照组的10倍以上;MSCV/puro-fgfr3-DN转染组(K562-DN)的截短型的FGFR3(K562-DN)高表达,而对照组和K562-WT转染组则无此片段;流式细胞术检测,K562-WT组有57.5%的细胞高表达FGFR3,K562-DN组有41.5%的细胞高表达FGFR3-DN。结论:成功构建高表达野生型和突变型FGFR3的人白血病细胞系K562。

主 题 词：受体,成纤维细胞生长因子,3型 真核表达载体 K562 细胞系 基因转染 白血病,粒-单核细胞,慢性 

学科分类：1007[医学-药学类] 1002[医学-临床医学类] 100214[100214] 10[医学] 

核心收录：

D　O　I：10.13481/j.1671-587x.20140301

馆 藏 号：203981396...