摘要：目的用Adeasy系统构建荧光蛋白基因标记的腺病毒载体Ad-hIGF-1,然后转染兔骨髓间充质干细胞并检测其表达。方法根据GenBank公布的hIGF-1序列设计PCR引物,从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短型hIGF-1,亚克隆至pMD-T载体,鉴定后酶切出目的基因插入pAdtrack-CMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdtrack-hIGF-1,经Pm eⅠ线性化后采用电穿孔法转化至已包含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的B J5183大肠杆菌中,挑选同源重组质粒线性化后转染HEK293细胞收获腺病毒,然后转染靶细胞兔骨髓间充质干细胞,通过绿色荧光蛋白表达情况以及流式细胞仪、免疫细胞化学等方法检测hIGF-1的表达。结果成功构建了绿色荧光蛋白基因标记的腺病毒Ad-hIGF-1,并在兔骨髓间充质干细胞得以高效表达。结论Adeasy腺病毒系统是基因转染的高效载体系统。腺病毒Ad-hIGF-1转染的骨髓间充质干细胞可作为基因修饰的软骨组织工程种子细胞。

摘要：背景：Adeasy腺病毒系统是由***等改良的基于E1和E3区缺失的重组腺病毒系统。相比传统的在真核细胞中收集和测试重组后的病毒颗粒的方法，其采用了在细菌中通过质粒同源重组的方法获得病毒颗粒，从而简化了腺病毒的构建和测试流程，而且，它能够通过整合入病毒基因组的标记基因GFP实现对转染细胞的荧光追踪，从而在近年来被广泛用作基因转染的载体。目的：用Adeasy系统构建荧光蛋白基因标记的腺病毒载体Ad-hIGF-1，并检测其在靶细胞骨髓间充质干细胞中的表达。设计：重复测量实验。单位：重庆医科大学儿科研究所。方法：实验于2004-11~005-03在重庆医科大学儿科研究所完成。①重组腺病毒载体的构建：从pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短的目的基因hIGF-1，按Ad—easy腺病毒系统同源重组的标准步骤获得重组阳性质粒pAd-hIGF-1和重组空白质粒pAd-0，电穿孔转化感受态XL—1细菌，扩增后获得重组腺病毒质粒，去内毒素质粒大抽试剂盒大量抽提质粒备转化HEK293细胞；②腺病毒包装及扩增：PacI酶切线性化pAd-hIGF-1和pAd-0，纯化后转染HEK293细胞，观察GFP的表达，待细胞90％以上漂浮后，冻融法裂解细胞收集第一轮病毒上清即为Ad—hIGF—1（重组目的腺病毒）和Ad-0（重组空白腺病毒），将收集病毒上清重复多次感染293细胞（乒乓交互感染）以提高病毒滴度。③骨髓间充质干细胞的培养及转染!采用通用的标准密度梯度离心法分离纯化兔MSCs于37℃、5％CO2孵箱培养，隔天换液，10d细胞融合达70％～80％，贴壁紧密，细胞形态均一，呈典型的涡漩状排列，传代至第3代按病毒感染复数分组转染。主要观察指标：①腺病毒载体的构建及鉴定。②目的基因hIGF-1在HEK293的表达及病毒滴度。③目的基因在骨髓间充质干细胞中的表达。结果：①重组腺病毒的鉴定：从质粒pcDNA3．1-hIGF—1中顺利扩增出约400bp大小的清晰条带，与预期相符；pMD18-hIGF—1测序结果经Blast2．0比对与公布序列一致性99．9％（281位碱基同义突变，未影响氨基酸翻译：ggt／ggc—Gly）：pAdtrack—CMV空载体和pAdtrack-hIGF-1分别双酶切（KpnI和HindIH）鉴定正确。质粒pAdEasey—1和Ad—hiGF-1用PacI酶切鉴定鉴定正确。证实病毒质粒同源重组成功。②荧光表达及滴度测定：重组质粒pAd—hIGF-1经PacI线性化后转化HEK293E细胞，48h后在荧光显微镜下即可见GFP的表达，72h表达最强。约5～7d后细胞出现病毒感染的特征性CPE，由此计算出腺病毒滴度为3．0×10^9pfu／mL。③靶细胞的感染及表达效率：病毒转染骨髓间充质千细胞24h后观察到绿色荧光的表达，72h左右荧光达到最强。免疫细胞化学SP法DAB染色显示在感染的骨髓间充质干细胞胞浆中有棕黄色阳性颗粒出现。SDSPAGE电泳在7．8KD附近出现明显条带，与实际人胰岛索样生长因子-1分子量7．6kD相符，证实转染含目的基因的重组腺病毒后的骨髓间充质干细胞中有较高量的人胰岛素样生长因子-1的表达。结论：本实验用Adeasy系统和扩增的截短型外源性基因hIGF-1构建了具有较强感染能力的腺病毒载体pAd-hIGF—1，免疫细胞化学和WesternBlot等方法检测证实了目的基因在靶细胞骨髓间充质干细胞得到了理想表达。

摘要：目的:构建增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced-green fluorescent protein,EGFP)标记的人胰岛素样生长因子(human insulin-like growth factor,hIGF-1)真核表达载体,转染至兔骨髓间充质干细胞,为组织工程关节软骨的构建提供基因改良的种子细胞。方法:实验于2005-03/2006-01在重庆医科大学儿科研究所完成。根据GeneBank公布的hIGF-1序列设计PCR引物,从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短型hIGF-1,亚克隆至pMD-T18载体,测序鉴定后酶切出目的基因片段并插入pIRES2-EGFP中,构建成真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1,经PCR及双酶切鉴定正确后用非病毒类纳米材料基因转移载体PAMAM-D介导转入兔骨髓间充质干细胞,通过荧光观察、流式细胞仪、RT-PCR等方法从各个水平检测hIGF-1在细胞的表达。结果:成功构建了增强型绿色荧光蛋白基因标记的真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1,并检测到目的基因hIGF-1在兔骨髓间充质干细胞的理想表达。结论:新型纳米材料PAMAM-D是高效、简便、表达持久的基因转染方法,经IGF-1基因修饰的骨髓间充质干细胞是软骨组织工程种子细胞的理想选择。

摘要：目的:应用影像归档和通信系统(picture archiving and communication system,PACS)和Photoshop系统辅助等腰三角形截骨并克氏针张力扣固定治疗儿童肘内翻的疗效分析。方法:回顾性分析自2014年10月至2019年10月采用肱骨远端等腰三角形截骨并克氏针张力扣固定治疗儿童肘内翻20例的临床资料,男13例,女7例;年龄3.2~13.5岁,中位数6.65岁;左侧12例,右侧8例。均为肱骨远端骨折畸形愈合后的远期并发症。术前用PACS系统设计截骨,模拟测量顶角位置及底边长度。再将图片导入Photoshop系统,画出术后模拟效果图,指导模拟截骨。结果:20例患儿均获得随访,时间20~24个月,中位数22.5个月。最后一次复查时患肢提携角5°~13°,中位数8.3°。疗效根据Flynn肘关节功能评分标准评价:优16例,良2例,可2例。结论:PACS和Photoshop系统辅助下等腰三角形截骨并克氏针张力扣固定治疗儿童肘内翻取得良好的临床疗效。

摘要：目的探讨一种预防和治疗肱骨髁上骨折以及并发肘内翻的临床疗效。方法将纳入患者分为肱骨髁上骨折组(A组)及骨折后肘内翻畸形组(B组),采用自行设计的双克氏针交叉外翻张力固定方法治疗。术后随访并评价疗效。结果术后骨折及截骨均愈合良好,肘关节功能恢复满意,A组肘内翻12例,发生率为3.9%,总优良率为88.9%;B组肘内翻复发2例,复发率为3.2%,总优良率为94%。结论克氏针交叉外翻张力固定是预防和治疗小儿肱骨髁上骨折后肘内翻的良好固定方法。