摘要：目的构建小鼠NGF基因治疗型DNA质粒,并进行中试工艺的优化。方法用SignalP3.0 Server软件选择并设计与NGF融合的信号肽;根据哺乳动物密码子偏爱性,对小鼠NGF的编码序列进行优化;通过流加补料等方式优化中试生产工艺;体外瞬时转染测定DNA质粒的表达和体外生物学活性。结果所构建的含有IgG/ngf的重组质粒,通过中试规模的发酵和纯化,获得了大量的高纯度重组质粒,该重组质粒可以在体外表达出具有生物学活性的NGF。结论构建了具有与小鼠NGF相似的生物学活性的重组质粒,并建立了中试生产工艺。

摘要：目的对重组2型腺相关病毒肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(recombinant adeno-associated virus 2 encoding tumor necrosis factor-related apoptosis-induced ligand,r AAV2-TRAIL)基因治疗制剂进行质量分析,并针对其关键质量属性建立质控方法。方法采用PCR法对r AAV2-TRAIL基因治疗制剂中插入的启动子CAG和目的基因TRAIL进行鉴别;在腺病毒(Ad5)的辅助下,将r AAV2-TRAIL体外感染293T细胞后,采用ELISA法检测培养上清中目的蛋白TRAIL的表达量,检测r AAV2-TRAIL对神经胶质瘤U251细胞的体外杀伤活性;设计引物及探针,采用Q-PCR法检测r AAV2-TRAIL基因治疗制剂中的r AAV2-TRAIL滴度、可能存在的复制型rc AAV滴度以及残余辅助病毒1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus 1,HSV1)滴度。结果启动子CAG和目的基因TRAIL的PCR鉴定结果与理论及理化对照品相符;r AAV2-TRAIL感染293T细胞48 h后,上清中TRAIL表达量为(0.36±0.18)ng/ml,RSD为50.0%;r AAV2-TRAIL体外作用于神经胶质瘤细胞U251,细胞生长相对抑制率为(26.6±3.75)%,RSD为14.1%;制剂中r AAV2-TRAIL滴度为(4.72×1011±0.52×1011)copies/ml,RSD为11.0%,rc AAV滴度为(2.49×107±0.18×107)copies/ml,RSD为7.2%,HSV1滴度为(6.02×106±0.51×106)copies/ml,RSD为8.5%。r AAV2-TRAIL/rc AAV为1.90×104,r AAV2-TRAIL/HSV1为7.84×104。结论建立的质控方法可用于r AAV2-TRAIL的质量控制,为该产品质量标准的建立奠定了基础,同时对以AAV为载体的基因治疗制剂的质量研究提供参考。

摘要：目的:评价国内药品检测实验室重组蛋白制品p H测定检验检测能力。方法:模拟重组蛋白制品设计并制备p H测定样品,以《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0631方法为检测方法,组织全国相关实验室对该样品进行p H测定检验检测,汇总结果后进行技术分析和统计分析,结果采用基于Robust统计量的Z比分数进行评价和报告。结果:30家实验室中,检测均数的|Z|值>3的实验室有1家(3.3%);全部检测值的|Z|值>3的有3家。总体而言,多数实验室(27家)检测结果良好。结论:多数实验室的重组蛋白溶液p H测定的能力验证结果令人满意,可以准确的给出检测值,并且与其他实验室的数据基本保持一致,本次p H测定的能力验证为重组蛋白制品检验能力的普及奠定基础。