摘要：目的人外周血淋巴细胞株8E5可分泌无感染性HIV-1病毒颗粒,靶向于8E5细胞株基因组整合的HIV-1前病毒基因POL区,基于CRISPR/Cas9点突变技术构建含有POL区耐药突变位点的单克隆细胞株,可用于制备一种安全稳定的新型HIV-1基因型耐药检测质控品。方法设计构建小向导RNA(single guide RNA,sgRNA)和Cas9共表达载体以及携带有目标突变位点的供体单链寡核苷酸(donor single-stranded oligonucleotides,Donor ssODN)共转染8E5细胞,通过流式微孔板分选获得转染成功的阳性单克隆细胞株,通过Sanger测序确认定点突变的编辑效果。对定点突变编辑成功的单克隆细胞株培养至第3代、5代和7代的细胞及细胞分泌到上清中的HIV病毒颗粒进行Sanger测序,验证定点突变的编辑效果。结果成功构建双sgRNA和Cas9共表达载体,与携带有耐药突变位点Q151M的Donor ssODN共转染8E5细胞株的效果良好。对分选获得的共转染阳性单克隆细胞株进行靶位点测序,结果显示成功构建了携带有定点突变Q151M的纯合子单克隆细胞株8E5Q151M。细胞株8E5Q151M多次传代后的细胞及细胞分泌的无感染性HIV-1病毒颗粒可被持续检测出Q151M突变位点。结论利用CRISPR/Cas9点突变技术成功构建稳定携带有Q151M耐药突变位点的细胞株8E5Q151M,为制备HIV-1基因型耐药检测质控品提供新的技术平台。

摘要：目的 基于二代测序技术建立一种适合我国主要流行亚型的HIV-1近全长基因组扩增和测序方法,并优化建立标准检测流程,为HIV-1的全基因组序列鉴定和相关系统进化分析等应用提供重要技术手段。方法 基于我国HIV-1主要流行亚型设计扩增引物,通过扩增两段交叉重叠的基因序列获得HIV-1近全长基因组。并通过使用不同反转录试剂与扩增试剂以及尝试不同反应体系和反应条件,分析对HIV-1近全长基因组扩增的效果以及进行二代测序所获序列质量的影响。结果 本研究基于二代测序技术建立的HIV-1近全长基因组扩增和测序方法可成功扩增我国主要HIV-1流行亚型CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B、CRF55_01B,进行二代测序所获基因组序列的平均比对率为95.18%(89.74%~99.16%),平均覆盖率为94.96%(83.58%~99.98%),平均测序深度为5323.10×(3026.68×~6790.57×)。进一步分析不同亚型毒株每个基因位点的测序深度覆盖图,发现CRF08_BC亚型与CRF105_0108亚型的毒株测序深度分布均匀,均高于6000×,其他亚型的毒株样本在6672~8196 bp之间有部分基因位点的测序深度较低。优化和建立的标准检测流程可成功扩增病毒载量大于104copies/mL的样本并获得准确的近全长基因组序列。结论 本研究基于二代测序技术建立了一种HIV-1近全长基因组扩增与测序方法,该方法可成功扩增我国主要流行亚型毒株,为我国应用HIV-1基因组序列开展艾滋病精准防控工作提供了重要技术支撑。

摘要：近年来电视剧产量持续增长,而品质却逐年下降,电视剧产业中更出现原创剧本受冷落、明星天价片酬等现象,严重阻碍我国电视剧产业的健康发展。基于这种现状,本文首先梳理我国电视剧产业链的营销模式,发现影视公司与电视台之间存在信息不对称;接着,以优质剧本具有稀缺性为前提,描述了影视公司与电视台之间的博弈,阐述了逆向选择现象形成的机理;最后提出培养创意型人才、提升编剧地位、限制演员片酬占制作费用比例的建议,以避免我国电视剧产业出现"劣剧驱逐良剧"的现象。