摘要：本研究基于胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis)16S rRNA基因保守序列,设计特异性引物和exo探针,建立了一种能够快速检测胞内劳森菌的实时荧光重组酶聚合酶扩增方法(real-time RPA)。进一步对real-time RPA方法的特异性和灵敏性进行了分析,对临床疑似病例的猪粪便和回肠样品进行了检测,并同real-time LAMP和real-time PCR检测结果进行了比较。结果表明,该方法能够在39℃等温条件下,20 min内实现对胞内劳森菌的有效检测;所建立的方法特异性强,仅对***产生特异性扩增,对其他常见引起猪腹泻的病原均无扩增;灵敏性高,以***基因组DNA为模板,检出限为1.4×10^2fg/μL;在60份临床样品中,该方法对***的检出率为66.7%(40/60),同real-time LAMP和real-time PCR方法一致。本研究所建立的real-time RPA方法反应快速、特异性强、灵敏性高,可用于猪场胞内劳森菌的快速检测。

摘要：从河北保定分离到一株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒,接种Marc-145细胞,经过两代盲传后,出现细胞病变,经鉴定为PRRSV,命名为BD株。根据GenBank公布的PRRSV JXA1株ORF4基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物,用RT-PCR方法扩增完整ORF4基因,将扩增产物连接到pMD19-T载体并转化克隆菌,将阳性重组质粒PMD-GP4进行测序分析。应用DNA St ar软件,将测序结果与国内外已发表毒株的ORF4基因进行序列比较,并绘制系统进化树。结果表明,BD株与JXA1、HB-3株遗传关系均较近。这为研制防治PRRSV的新型疫苗及诊断方法奠定了基础。

摘要：为建立一种简单、快速、特异的口蹄疫病毒(FMDV)分子检测方法,本研究基于FMDV的3D基因,设计特异性引物和exo探针,建立了用于FMDV快速检测的等温实时荧光反转录重组酶聚合酶(Real-time RT-RPA)方法。该方法采用便携式等温扩增仪-Genie Ⅲ实时监测扩增结果,40℃20 min即可完成检测。结果显示,FMDV RT-RPA方法能够特异性扩增FMDV 3D基因,而对水泡性口炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、脑心肌炎病毒等均无扩增;以体外转录的FMDV 3D RNA作为模板,该方法在95%置信区间检出下限为1.0×10~2拷贝/μL,组内和组间变异系数均小于1%;使用43份含有灭活FMDV的模拟临床样品分析显示,RT-RPA对FMDV的检出率为34.9%(15/43),略低于荧光定量RT-PCR的检出率(39.5%,17/43),而两种方法的符合率为95.3%(41/43)。RT-RPA能够在6 min～16 min内完成检测,而实时荧光RT-PCR则需要30 min～51 min。本研究所建立的实时荧光RT-RPA方法反应快速,特异性强,灵敏性高,操作简单,结合便携式具有荧光检测功能的等温扩增仪Genie Ⅲ,组建了FMDV快速检测平台,在基层兽医部门,尤其在野外及疫情现场的FMDV检测中具有极大的应用潜力,为设备仪器有限的实验室和田间对FMDV的快速检测提供了一种有效的方法,对于条件有限地区FMD的防控具有重要意义。

摘要：参照GenBank收录的PCV4 ORF2基因保守序列,设计合成了1对特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应体系,建立了针对PCV4的实时荧光PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行评价。结果显示,该方法的Ct值与标准品在1.53×10^(3)~1.53×10^(7)拷贝/μL范围内呈良好的线性关系,R^(2)值为0.999;特异性强,仅对PCV4呈特异性扩增,与PCV1、PCV2、PCV3以及其他多种猪常见病原均无交叉反应;敏感性高,最低检测限为1.53×10^(1)拷贝/μL反应;重复性好,组内、组间变异系数均小于2%。使用该方法对采集自2013—2020年间河北省10个地区不同养殖场和屠宰场的868份猪组织样本进行PCV4检测,结果表明PCV4的阳性检出率为1.27%(11/868)。ORF2基因测序分析表明,河北省分离株同国内其他分离株的ORF2同源性为98.4%~99.6%。本研究建立的实时荧光PCR方法对PCV4的病原学监测和流行病学调查具有重要意义。

摘要：以细菌生长速度、以及细菌在腐植酸微污染水中对CODMn、UV254和Color410的降解能力为筛选标准,从自来水厂实际使用的生物活性炭上分离并经驯化的20株细菌中,筛选出一株与食酸菌属菌株MN33.2(Acidovorax ***33.2)同源性为99%的腐植酸降解菌。在腐植酸初始浓度为5～20mg/L,pH为3～8,水温为20～35℃,以及反应时间为24h条件下,该菌株对腐植酸微污染水样中CODMn的去除率呈现出随腐植酸初始浓度增加或水温的提高、或随pH降低而增加的趋势。在腐植酸初始浓度为20mg/L、pH为7、水温为20℃、反应时间为48h条件下,该菌株对腐植酸微污染水样中CODMn的去除率达到49.1%。

摘要：根据禽腺病毒4型(FAdV-4)Hexon基因核苷酸序列,设计用于扩增FAdV-4的PCR引物,建立了FAdV-4 PCR检测方法。特异性和敏感性实验结果表明,该方法可扩增出954 bp的特异性核酸片段,而对禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒与禽腺病毒11型的检测结果均为阴性,对FAdV-4的最低核酸检出量为12.9 pg。该方法可用于禽腺病毒4型的临床检测与流行病学调查。

摘要：为建立一种简单、快速的非洲猪瘟病毒（ASFV）分子检测方法,基于ASFV P72基因保守序列,设计并合成引物,建立了一种ASFV重组酶聚合酶扩增（RPA）等温检测方法。结果表明,所建立的RPA方法在38℃水浴锅中恒温反应30 min,即可实现对目的片段的有效扩增;以包含ASFV P72基因的ORF质粒为模板,RPA的检测限达到10～2 copies,同世界动物卫生组织（OIE）推荐的实时荧光PCR方法检测限一致,但比OIE推荐方法的检测限高10倍;RPA仅特异性扩增ASFV P72基因,对FMDV、CSFV、PRRSV、PRV和PCV-2基因组c DNA或DNA没有扩增。本研究所建立的RPA方法操作简单、反应快速、检测成本低、结果确实可靠,为非洲猪瘟的一线防控提供了一种新的、可靠的技术支持。

摘要：本研究基于猪瘟病毒(CSFV)5’UTR保守序列,设计特异性引物,建立了可快速检测CSFV的反转录重组酶聚合酶扩增检测方法(reverse-transcription recombinase polymerase amplification,RT-RPA)。该方法在40℃下恒温20 min即可完成反应;且特异性强,与其他瘟病毒和猪的重要病原无任何交叉反应。以体外转录的CSFV RNA为模板,该方法的检出下限为10~2copies。采用RT-RPA方法和实时荧光RT-PCR(real-time RT-PCR)方法同时对57份临床样品进行CSFV检测,结果,RT-RPA方法的阳性检出率为56.14%(32/57),略低于real-time RT-PCR方法的阳性检出率(64.19%,37/57)。以real-time RT-PCR作为参考方法,所建立的RT-RPA方法的诊断特异性为100%,诊断灵敏度为89.19%。上述结果表明,本研究建立的CSFV RT-RPA检测方法操作简单、反应快速,对没有装备荧光PCR仪地区的猪瘟诊断防控具有重要意义。

摘要：为建立可以区分H7亚型流感病毒强弱毒的方法,根椐Genbank和GISAID中H7病毒的HA基因序列,设计2条特异性引物,建立了扩增H7病毒HA裂解位点区域的通用RT-PCR方法。在此基础上,在裂解位点处设计1条引物,建立了可以区分H7强弱毒的RT-PCR方法。该方法对弱毒株可以扩增出约337 bp的片段,对强毒株可以扩增出约349 bp和227 bp的片段,对其他常见亚型流感病毒的RT-PCR扩增均为阴性。敏感性试验结果表明,该RT-PCR方法的检测下限为1 fg的H7N9病毒模板。该方法对10份实验室已鉴定好的H7N9病毒进行对比验证,两者的符合率为100%。试验结果表明,该方法具有特异、快速、敏感、准确的特点,可用于H7亚型流感病毒的快速检测,同时还可区分强弱毒,对H7N9病毒,尤其是高致病性病毒的早期诊断和有效防控可提供有效技术支撑。

摘要：[目的]建立一种快速、敏感、特异的检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)方法,为诊断与监测BVDV提供准确可靠工具。[方法]根据GenBank公布的BVDV序列,在其保守序列区域设计了一套LAMP引物,优化了反应时间与反应温度,建立了检测BVDV的RT-LAMP方法。[结果]该方法能在56℃等温条件下40分钟完成扩增,扩增结果可通过凝胶电泳梯形带判定。该方法具有良好的特异性和敏感性,最低能检测到3.74×100copies/μl的病毒RNA,而且与其他病毒无交叉反应。[结论]该方法能用于牛病毒性腹泻病毒的诊断与监测。