摘要：目的通过构建严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)S1蛋白与通用型辅助性T淋巴细胞表位(pan HLA DR-binding epitope,PADRE)融合的DNA疫苗,探讨PADRE对S1蛋白DNA疫苗诱导抗体水平的影响。方法以pJW4303质粒为载体分别构建表达S1蛋白的重组质粒(pJW4303-S1)、表达S1和PADRE融合蛋白的重组质粒(pJW4303-S1-PADRE)。以人源密码子优化的SARS-CoV-2刺突蛋白基因为模板设计引物,PCR扩增获得基因片段,并将其克隆入真核表达载体pJW4303。对pJW4303-S1、pJW4303-S1-PADRE进行PCR扩增和酶切,产物通过琼脂糖凝胶电泳验证,并将重组质粒进行测序。构建正确的质粒转染293T细胞,Western blot验证蛋白体外表达情况。以C57BL/6小鼠为实验动物并分组,采用不同的免疫接种策略进行动物免疫,每次免疫间隔2周,免疫前采血,第6次免疫2周后处死小鼠并采血。通过ELISA检测不同免疫策略诱导的针对SARS-CoV-2 S蛋白受体结合域(receptor binding domain,RBD)的特异性抗体水平及其亲和力指数。结果PCR扩增和酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果及质粒测序结果表明质粒构建成功;Western blot结果表明这2个质粒可以在体外稳定表达S1蛋白、S1融合PADRE蛋白;ELISA结果显示,pJW4303-S1、pJW4303-S1-PADRE单次免疫均可以诱导产生明显的针对RBD的抗体水平(P0.05)。抗体亲和力检测结果显示,第6次免疫后不同免疫策略诱导的针对RBD的抗体亲和力指数差异也无统计学意义(P>0.05)。结论pJW4303-S1、pJW4303-S1-PADRE均具有较强的体液免疫原性,但PADRE不能进一步提高S1蛋白DNA疫苗的体液免疫原性。

摘要：目的 分析研究不同感染时间和不同途径感染HIV／AIDS感染者覆盖全基因组的CTL应答特征。方法 将75例HIV／AIDS感染者分为3组，血液感染1～2年组（10例）、血液感染〉10年组（43例）和性接触感染1～2年组（22例）；以HIV—lB亚型构建全基因组17个肽库作为抗原，采用ELISpot检测各组HIV特异性CTL应答；采用流式细胞术检测各组CD。计数；采用实时定量tit—PCR检测各组HIV病毒载量。结果血液感染1～2年组、血液感染〉10年组和性接触感染1～2年组感染者对HIV—B亚型17个肽库的平均应答频率分别为40％、65％、23％，经单向方差分析，3组感染者对HIV·1B亚型17个肽库的应答频率差异有统计学意义（F=19．96，P〈0．01）；3组感染者对HIV—B亚型17个肽库总应答强度范围分别为0～5835SFCs／10。PBMC、0～7225SFCs／10。PBMC、0～9740SFCs／IO。PBMC，且3组感染者对HIV—B亚型17个肽库的应答强度差异亦有统计学意义（H=101．90，P〈0．01）；此外，3组感染者对HIV—lB亚型17个肽库的应答广度分别为7（2—11）个、11（9—14）个、4（2—6）个，5组感染者应答广度的差异也有统计学意义（H=34．75，P〈0．01）。3组感染者应答频率、应答强度和应答广度从高到低依次为血液感染〉10年组、血液感染1—2年组、性接触感染1～2年组。不同感染时间和不同感染途径的感染者对Nef肽库和Gag肽库的应答百分比和应答强度均高于其他肽库。cD。计数〈200／~1、CD。计数为200～500／~1和≥500／~15组感染者对17个肽库的总应答强度范围分别为0～18475SFCs／10。PBMC、350～34095SFCs／10。PBMC、490～21550SFCs／IO。PBMC，但差异无统计学意义（H=2．93，P=0．23）；3组感染者CTL应答广度分别为3（0～8）个、10（2～17）个、10（1～17）个，3组间差异有统计学意义（H=14．72，P〈0．01），cD4计数〈200／~1的感染者CTL应答广度低于cD。计数为200—500／~]和≥500／“l组。不同病毒载量3组（〈LDL、LDL一1×10。拷贝／ml和≥1×10。拷贝／m1）标本对17个肽库的总应答强度范围分别为490—18475SFCs／10。PBMC、0～24115SFCs／10。PBMC、770～34095SFCs／10。PBMC，但3组间差异无统计学意义（H=0．79，P=0．67）；应答广度分别为8（1～17）个、11（0～17）个、8（1～16）个，3组间差异也无统计学意义（日=5．27，P=0．07）。结论中国HIV／AIDS感染者中CTL应答多集中在Nef和Gag，这两个抗原为HIV／AIDS感染的优势抗原；感染时间和感染途径对CTL应答可产生显著影响；随感染时间的延长，免疫反应的强度与应答比例均增加。这些信息对设计针对中国人群的AIDS疫苗有较重要意义。