摘要：目的利用穿梭质粒通过同源重组构建表达SARS-CoV-2 RBDEPI蛋白重组痘苗病毒,并对其进行筛选、鉴定和免疫原性检测。方法参照SARS-CoV-2全基因组序列设计合成目的基因RBDEPI,通过PCR、测序、酶切连接将目的基因插入到痘苗病毒穿梭载体pSTKE中,构建pSTKE-RBDEP。将pSTKE-RBDEPI与天坛株痘苗病毒VTT共转染鼠肾细胞BHK-21中,通过同源重组,并以增强型绿色荧光蛋白EGFP为筛选标记,通过多次绿色荧光噬斑筛选获得重组病毒rVTT△TK-RBDEPI。利用RT-PCR和Western blot检测rVTT△TK-RBDEPI目的基因的转录和目的蛋白的表达情况;通过ELISA和ELISPOT检测rVTT△TK-RBDEPI免疫小鼠SARS-CoV-2与痘苗病毒载体特异性抗体水平和特异性淋巴细胞IL-4与IFN-γ的表达情况,确定rVTT△TK-RBDEPI的免疫原性。结果经过10次绿色荧光噬斑筛选、RT-PCR与Western blot鉴定获得1株能够表达SARS-CoV-2 RBDEPI的重组痘苗病毒rVTT△TK-RBDEPI,且rVTT△TK-RBDEPI具备良好的免疫原性。结论获得能够表达SARS-CoV-2 RBDEPI的重组痘苗病毒,该疫苗具有免疫原性,为以痘苗病毒为载体的SARS-CoV-2疫苗的进一步研究和临床治疗奠定了基础。

摘要：目的构建E3L基因缺失型痘苗病毒,并评价其毒力和安全性。方法根据天坛株痘苗病毒全基因组设计合成以E3L基因为重组臂,并含有Loxp序列、早晚期复合强启动子(PE/L)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、终止信号(T5nT)的重组痘苗病毒穿梭质粒pVTTΔE3L-EGFP,然后利用同源重组和Cre/Loxp系统构建E3L基因缺失型痘苗病毒VTTΔE3L。检测VTTΔE3L对BHK-21、HEK-293、***、Marc-145和DF-1细胞存活率的影响并测定其在上述细胞中的一步生长曲线,初步明确VTTΔE3L的毒力和复制能力;连续传代40代,检测VTTΔE3L的遗传稳定性;滴鼻感染BALB/c小鼠,检测其对小鼠体重变化的影响,初步明确VTTΔE3L的安全性。结果利用EGFP筛选标记和Cre/Loxp特异性敲除系统,通过多次挑斑筛选获得了E3L基因缺失型痘苗病毒VTTΔE3L,且PCR鉴定VTT目的条带大小为359bp,rVTTΔE3L-EGFP目的条带大小为1206bp。结晶紫染色图表明VTTΔE3L对BHK-21细胞的抑制作用明显弱于VTT,通过连续传代40代,PCR没有检测到重组痘苗病毒VTTΔE3L的目的条带,确定了VTTΔE3L具备良好的遗传稳定性。细胞生存率检测表明随作用时间的延长VTTΔE3L对不同株细胞的杀伤作用显著低于VTT,在48h和72h时VTTΔE3L与VTT对不同细胞的抑制作用存在显著性差异(P0.05)。结论成功获得E3L基因缺失型痘苗病毒VTTΔE3L,其安全性良好,为以痘苗病毒为载体的疫苗研究和临床应用奠定了基础。