摘要：目的为适应流感疫情监测中快速诊断的需要,建立敏感特异的流感病毒多重逆转录PCR(MRTPCR)检测方法。方法对甲1型(H1N1)、甲3型(H3N2)、乙型流感病毒的血凝素(HA)基因保守区域分别设计引物进行MRTPCR。另设计了两对引物对H1N1和H3N2亚型流感病毒的神经氨酸酶(NA)N1、N2作亚型判断。结果MRTPCR可特异性检测出各型流感病毒的目的片段,相互间无交叉反应。二次PCR反应后对H1N1、H3N2流感病毒的检测灵敏度可达0.10TCID50/50μl以下,对乙型流感病毒的检测灵敏度可达0.01TCID50/50μl以下。应用此方法也可特异性地检测出H1N1和H3N2流感病毒的NA基因。结论用MRTPCR从临床患者含漱液标本中检出相关流感病毒的灵敏度要高于用狗肾传代细胞(MDCK)或鸡胚分离的灵敏度,达到了快速、敏感、正确检测流感病毒及其亚型的目的。

摘要：目的建立一种特异、灵敏、快速的荧光定量RTPCR方法用于检测甲3型流感病毒核酸。方法根据GenBank登录的流感毒株序列,应用生物学软件进行序列比对,在甲3型流感病毒血凝素(HA)基因的保守区设计引物和TaqMan探针、并进行筛选。对荧光RT-PCR反应条件进行优化,检测该方法的特异性和灵敏度。并对疑似流感含漱液标本进行检测。结果该方法对甲3型流感病毒的检测有高度的特异性,对甲1型、乙型、禽流感病毒H5、SARS病毒及其他呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.01TCID50,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右。结论本研究建立的TaqMan荧光定量RTPCR是一种快速检测甲3型流感病毒特异、敏感的新方法。

摘要：目的　建立腮腺炎病毒的核酸快速诊断技术。方法　在腮腺炎病毒核蛋白基因 (NP)的保守区域设计一对半引物 ,采用逆转录聚合酶链 (RT -PCR)和半巢式PCR方法扩增腮腺炎病毒特异性核酸片段。结果　该方法能特异性地扩增腮腺炎病毒 3 5 7bp和 2 3 2bp的核酸片段 ,而对麻疹、风疹和流感病毒无交叉反应。检测腮腺炎病毒的灵敏度 ,1次PCR可检测出 10CCID50 ,2次PCR反应可达 0 1CCID50 。采用该方法从流行性腮腺炎患者含漱液标本中能直接检出腮腺炎病毒核酸条带。结论　该方法能特异、敏感地检测临床标本中腮腺炎病毒 。

摘要：建立以TaqMan-MGB荧光探针为特点的荧光定量RT-PCR方法,用于检测H5亚型禽流感病毒。针对H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因保守区域设计特异性引物与TaqMan-MGB荧光探针,筛选并优化荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件,用以提高方法的特异性、敏感性与准确性;并通过体外克隆技术建立病毒基因拷贝数进行定量分析。结果表明:引物与探针的优化浓度分别640nmol/L和480nmol/L,体系具有良好的保守性和特异性,与其他呼吸道病毒均无交叉反应。方法检测灵敏度为100拷贝/反应,标准曲线线性范围为107～102拷贝/反应,从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,操作简便,重现性好。本研究建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法特异、敏感、快速,适合于临床实验室进行H5亚型禽流感病毒的快速定量检测。

摘要：目的建立特异、灵敏、快速的荧光定量RT-PCR方法用于检测登革1、2型病毒核酸,并初步应用于登革热的临床标本检测。方法根据GenBank登录的登革热毒株序列,应用生物学软件进行序列比对,分别在登革病毒1型的NS5基因和2型的C基因的保守区设计特异性引物和TaqMan探针。对荧光定量RT-PCR反应条件进行优化,验证该方法的特异性、灵敏度和稳定性。同时对疑似登革热病例血清标本进行检测。结果该方法对登革1、2型病毒的检测有高度的特异性,与登革病毒的4个血清型之间以及流行性乙型脑炎病毒、肾综合征出血热病毒等均无交叉反应,检测的灵敏度均达0.1TCID50,可从疑似登革热病例血清标本中直接检测登革病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右。结论本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测登革1、2型病毒特异、敏感的方法,适用于临床早期诊断。

摘要：目的建立特异、快速、灵敏的TaqMan实时荧光定量聚合酶链反应（TaqMan—based Real—timePCR）用于西尼罗病毒（WNV）核酸检测，为WNV的感染诊断和流行病学监测奠定技术基础。方法根据文献公开发表的WNV核酸检测引物和TaqMan探针，优选最佳引物探针。应用DNAWorks2．4在线软件设计8条寡核苷酸片段，基于PCR合成包含引物探针扩增区域的230个核苷酸作为WNV模拟核酸。并对TaqMan-based Real—timePCR条件进行优化，验证该方法的特异性、灵敏度。结果该方法对WNV核酸检测有高度特异性，与流行性乙型脑炎、登革热1～4型等虫媒病毒均无交叉反应，对构建的DNA检测灵敏度达100拷贝／反应。结论TaqMan—based Real—timePCR是一种快速检测WNV特异、敏感的方法，适用于WNV的早期感染诊断和流行病学监测。

摘要：目的建立双重荧光定量RT-PCR技术,用于同时快速检测肠道病毒(Enteroviruses,EV)和水痘-带状疱疹病毒(Varicella-Zoster virus,VZV)。方法从GenBank上下载不同年份和地区的EV和VZV基因序列,分别在其保守区域设计引物与TaqMan探针,建立优化单重和双重荧光定量RT-PCR反应体系,评价所建双重RT-PCR反应体系的特异度、敏感度和稳定性,并应用于临床标本的检测中。结果该方法对EV和VZV检测具有高度特异性,检出限分别为30 copies/μl和36copies/μl,从疑似EV/VZV患者临床标本中直接检测EV与VZV,整个操作过程仅需3 h。结论本研究建立的双重荧光定量RT-PCR方法可以同时鉴别EV与VZV,具有特异性好、灵敏度高、快速易操作等优点,适用于EV/VZV早期感染病例的快速确认以及暴发疫情的应急诊断。

摘要：目的建立B型人呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)的快速荧光定量RT-PCR检测方法,用于B型RSV实验室早期诊断与病毒核酸的定量分析。方法利用B型RSV N基因保守区设计引物和TaqMan-MGB(minor groove binder,DNA小沟结合物)探针,优化反应体系和反应条件;并对方法进行特异性、灵敏度和重复性评价;同时以10倍梯度稀释的质粒为标准品建立荧光定量RT-PCR的标准曲线,构建定量分析模型。并用该方法对100份临床呼吸道样本进行检测。结果该方法与其他呼吸道病毒均无交叉反应,检测灵敏度达1TCID50/ml50%组织培养物感染剂量病毒滴度,临床样本中B型RSV的检测阳性率达18%。结论B型RSV荧光定量RT-PCR检测方法快速、敏感、特异,适用于B型RSV的早期诊断和核酸定量分析。

摘要：目的建立一种特异、灵敏、快速的荧光定量RT-PCR方法检测肠道病毒核酸,应用于暴发疫情的实验室应急检测。方法根据GenBank登录的肠道病毒基因序列,应用生物学软件进行序列比对,在肠道病毒基因的保守区设计特异性引物和TaqMan探针;对荧光RT-PCR反应条件进行优化,验证方法的特异性和灵敏度。同时对疑似肠道病毒感染者的临床样本进行检测。结果该方法对肠道病毒的检测有高度的特异性,可检出脊髓灰质炎、柯萨奇和埃可等肠道病毒,与腮腺炎、麻疹、风疹、乙型脑炎等病毒均无交叉反应。检测的灵敏度达0.1病毒效价滴定(TCID50);可直接从疑似肠道病毒感染者的脑脊液、疱疹液和粪便等标本中检测肠道病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右。结论所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测肠道病毒特异、敏感的方法,适用于由肠道病毒感染引起的应急疫情的实验室早期诊断。

摘要：目的　建立特异敏感的快速检测流感病毒的分子生物学方法。方法　用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增甲1、甲3 和乙型流感病毒的HA基因的HA1片段。根据扩增产物的大小检测流感病毒。结果　以流感病毒的HA基因为模板设计的 3对引物能特异性地扩增出 94 2bp、1117bp和 75 1bp的核酸片段 ,它们分别和甲1,甲3 和乙型流感病毒有稳定对应关系。根据扩增产物的大小可以检测流感病毒。用这个方法能检测病毒浓度为0 1TCID50 的样品。结论　多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应是检测流感病毒的特异敏感的方法。