摘要：为了解人类肠道病毒68型3A蛋白可溶区的结构,本研究构建了EV-D68 3A蛋白可溶区的原核表达载体,在大肠杆菌中表达、纯化并对其结构进行了初步研究。首先,采用PCR的方法扩增EV-D68 3A（1~61）基因片段,克隆至原核表达载体pET-28a-His-SUMO中,转化进入BL21（DE3）感受态细胞,诱导表达出His-SUMO-3A（1~61）融合蛋白。经Ni-NTA树脂亲和层析初步纯化后得到大量融合蛋白,利用ULP酶酶切去除His-SUMO标签,通过Ni-NTA树脂亲和层析、阴离子交换层析柱、分子筛层析等方法分离标签并进一步纯化目的蛋白。最后通过化学交联反应检测目的蛋白的多聚化状态。结果显示,利用pET28a-His-SUMO-3A（1~61）原核表达载体能够在大肠杆菌中成功表达出大量可溶性的融合蛋白;经过多步纯化方法得到了大量高纯度的目的蛋白,平均每升大肠杆菌可得到约5mg目的蛋白,纯度达95%以上;通过化学交联反应证明了该蛋白的多聚化存在形式。本研究成功建立了EV-D68 3A蛋白可溶区的表达和纯化系统,为进一步获得3A蛋白晶体、研究3A蛋白功能以及设计以3A为靶点的抗病毒药物奠定了基础。

摘要：至今,艾滋病仍是人类历史上最严重的传染病之一。设计和生产具有保护效力的预防型HIV-1疫苗一直被认为是战胜艾滋病的最佳途径。虽然经过了数十年的努力,但有效的HIV-1疫苗仍未研制成功。在进入临床试验的5种疫苗中,只有RV144实验显示出31%的保护效力,但并不能控制已感染者病情进程。通过临床实验数据和体外实验分析,目前主要有两种免疫原设计策略:诱导广谱中和抗体(bNAb)和有效的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。诱导bNAb可以阻止病毒感染或者降低感染率,其主要免疫原包括:病毒样颗粒、天然包膜蛋白三聚体和稳定的bNAb结合表位等。而诱导有效的CTL应答可以减缓病毒感染进程,其主要免疫原包括:"马赛克"疫苗、保守区免疫原和病毒适应性图谱指导的免疫原等。本文将主要阐述这两种免疫原设计策略及其研究进展。

摘要：目的构建重组人APOBEC3H hapⅡ(A3H hapⅡ)杆状病毒表达载体,在昆虫细胞表达系统中表达,表达产物经Ni-NTA亲和层析柱纯化。方法采用PCR方法扩增A3H hapⅡ基因并加入His标签后,克隆至杆状病毒转移载体p Fast Bac1中,转化*** DH10Bac感受态细胞进行重组,构建质粒Bacmid-A3H hapⅡ-His。将质粒转染昆虫细胞sf9获得P1病毒,扩增后获得P3病毒,感染sf9细胞表达目的蛋白,并进行Western blot鉴定。经Ni-NAT树脂亲和层析柱对表达的蛋白进行纯化,并通过免疫共沉淀试验检测A3H hapⅡ-His与其相互作用蛋白HIV-1 Vif之间的特异性结合。结果成功构建了质粒Bacmid-A3H hapⅡ-His;P3病毒感染sf9细胞后成功表达出相对分子质量约20 000的目的蛋白,且能够与HIV-1 Vif特异性结合。结论成功建立A3H hapⅡ昆虫表达体系,为进一步研究A3H hapⅡ与HIV-1 Vif之间的相互作用机制,并针对其相互作用位点设计抗HIV药物奠定了基础。