摘要：目的:筛选具有免疫源性HLA-A*02限制性表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)exon20插入突变编码的优势表位肽,为携带EGFR exon20插入突变的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)提供新的免疫治疗手段。方法:通过IEDB、NetMHC 4.0和SYFPEITHI软件,筛选EGFR exon20插入突变编码的HLA-A*02限制性表位,针对细胞毒性T淋巴细胞表位集中区域设计多肽疫苗,通过体外实验验证其免疫活性。结果:V769_D770insASV为EGFR exon20插入突变最高频突变位点(19.35%),经软件预测其编码的多肽YVMASVASV与HLA-A*02具有较强的结合力。围绕核心序列设计两条优势表位多肽E-ASV-10和E-ASV-19,体外可诱导HLA-A~*02限制性T细胞的扩增和活化,上调4-1BB^+CD25^+细胞比例,促进CD4^+、CD8^+T细胞IFN-γ的合成和释放。多肽E-ASV-10可刺激C57BL/6小鼠的T细胞分泌IFN-γ,对携带V769_D770insASV的小鼠NSCLC细胞LLCasv具有杀伤活性。结论:E-ASV-10和E-ASV-19多肽不仅可以在体外诱导人HLA-A*02限制性T细胞的扩增和活化,而且在C57BL/6小鼠中诱导特异性靶向携带V769_D770insASV突变的小鼠肺腺癌(lewis lung cancer,LLC)的杀伤性T细胞,提示其作为一种新的肿瘤疫苗或可用于治疗携带相应EGFR exon20插入突变的NSCLC,具有潜在临床应用前景。

摘要：目的　特异克隆MAGE A1开放读码框基因,构建以绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的包含MAGE A1的真核表达载体并转染人PBMC来源DC细胞。方法　根据MAGE A1特征序列设计PCR扩增引物,从Mel 5 2 6中扩增MAGE A1基因开放读码框,并克隆至pIRES EGFP中,构建人重组pMAGE A1 EGFP真核表达质粒。利用电转染方法将该重组质粒转入人外周血来源DC细胞并检测MAGE A1和EGFP的表达情况。结果　成功构建真核表达质粒pMAGE A1 EGFP ,转染人PBMC来源DC细胞并检测到MAGE A1和EGFP表达,两者表达率分别为(8.8±0 .9) %和(8.4 7±0 .78) % ,无统计学差异。结论　成功构建人重组真核表达质粒pMAGE A1 EGFP ,为开展MAGE A1为基础的免疫治疗提供有利的分子生物学工具。

摘要：目的:构建一个含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因,并能够用于鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(mGM-CSF)基因修饰性肿瘤疫苗研究的质粒载体。方法:利用常规分子生物学方法设计并构建含有一个mGM-CSF基因和一个EGFP基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-mGM质粒,经EcoR I及BamH I双酶切鉴定并测序。通过脂质体法转染LA795肺癌细胞,用荧光显微镜检测细胞中EGFP的表达,用ELISA法检测细胞中mGM-CSF的表达。结果:构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-mGM,用脂质体法转染LA795肺癌细胞后,经荧光显微镜和ELISA法检测,可见细胞内有EGFP及mGM-CSF的表达。结论:成功地构建真核表达载体pIRES2-EGFP-mGM,并在LA795肺癌细胞中表达,为研究GM-CSF对肿瘤的生物学作用以及GM-CSF在基因修饰性肿瘤疫苗中的应用奠定了基础。

摘要：目的:构建iASPP真核表达载体,稳定转染小鼠成纤维细胞(NIH3T3)并检测其表达,观察其对NIH3T3细胞增殖的影响。方法:设计引物以源克隆PCMV-iASPP为模板PCR扩增其中的CDS区,亚克隆入FLAG-pcDNA3.0,将该重组质粒转化DH5α感受态大肠埃希菌,筛选阳性克隆,经酶切、测序鉴定后,用脂质体介导转染NIH3T3细胞,G418加压筛选28 d,RT-PCR、West-ern blotting检测基因、蛋白表达;MTT法观察细胞增殖能力。结果:重组质粒鉴定正确,筛选所得阳性克隆中可以检测到iASPP基因的转录和表达,且该iASPP阳性表达细胞株增殖能力明显增强。结论:成功构建iASPP真核表达载体并成功构建稳定表达iASPP的NIH3T3细胞株,证明该基因的稳定表达在体外能显著增强NIH3T3细胞增殖能力。