摘要：背景:转化生长因子β1对骨髓间充质干细胞成骨和成软骨的促分化作用已被广泛证实。目的:假设转化生长因子β2可在体外诱导鼠脂肪间充质干细胞向成软骨细胞分化,实验拟验证其可行性。设计、时间及地点:体外细胞学实验,于2007-03/11在北京大学第三医院中心实验室完成。材料:清洁级3周龄雄性Lewis大鼠24只,用于分离培养脂肪间充质干细胞。方法:取第2代脂肪间充质干细胞,通过10μg/L外源性转化生长因子β2以离心管内微团培养、单层培养两种方式向软骨细胞进行诱导分化,培养3周。对照组单纯加入基础培养液。主要观察指标:两种诱导方式下细胞(团)形态结构的变化、Ⅱ型胶原免疫组织化学检测结果、软骨细胞特异性基因Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA的表达。结果:微团培养诱导的脂肪间充质干细胞组织块经苏木精-伊红染色显示在组织内部形成类似软骨陷窝样结构,阿尔新蓝染色呈强阳性,II型胶原免疫组化结果显示有棕褐色强阳性颗粒,RT-PCR检测到II型胶原和Aggrecan mRNA的表达。单层培养诱导的脂肪间充质干细胞无细胞外软骨基质分泌,未发现II型胶原蛋白和Aggrecan mRNA的表达。结论:在离心管内微团培养方式下,转化生长因子β2可以启动或促进脂肪间充质干细胞的软骨分化,且分泌软骨细胞特异性基质。简单的单层培养方式诱导失败。

摘要：通过经典的建立膝骨关节病运动模型的方式，设计了在切除内侧半月板的情况下，将内侧副韧带（ＭＣＬ）切断和切断后再缝合恢复张力的两组动物模型。观察术后５、１０、１５、２０天，关节软骨的组织学、组织化学及扫描电镜下形态学方面的变化，旨在探讨切除内恻半月板时，恢复ＭＣＬ的张力对膝骨关节病（ＯＡ）发病过程的影响。实验结果显示，ＭＣＬ切断无张力组和ＭＣＬ缝合有张力组于术后５天，在光镜下，关节软骨即出现某此变化。包括敕骨细胞排列紊乱，增生层有软骨细胞簇集现象、族集细胞的周围甲苯胺兰深染。增生层和肥大层一些软骨陷窝有细胞消失现象，其周围淡染。术后５、１０天扫描电镜观察，两实验组关节软骨表面未见异常改变。术后１５、２０天，光镜下，两实验组关节软骨退行性改变进一步加重，扫描电镜观察，两实验组软骨表面正常结构消失、胶原纤维断裂，软骨显微骨折、出现部分软骨细胞裸露及细胞消失现象。韧带无张力组及有张力组，在软骨退行性变化方面未见明显程度上的差别，结果表明，只要兔半月板切除，无论ＭＣＬ张力存在与否，都不能阻止ＯＡ的产生，亦不能减轻其发生的程度。

摘要：目的:研究siRNA抑制Smad4基因表达治疗异位骨化大鼠模型的效果,并与抑制Runx2的疗效进行比较。方法:1、设计6条分别针对大鼠Smad4和Runx2的mRNA模板,用体外转录合成法分别合成6条siRNA,采用RT-PCR从mRNA水平在培养的原代成骨前体细胞中筛选有明显抑制作用的siRNA。2、设计合成针对Smad4基因和Runx2基因编码的发卡样siRNA的双链DNA,与腺病毒的穿梭质粒连接后,取其启动子和终止子连接于非病毒载体上。在培养的大鼠原代成骨细胞中,采用RT-PCR和western blot测定Smad4特异性siRNA非病毒对Smad4的抑制作用和Runx2特异性siRNA非病毒对Runx2的抑制作用。3、采用体内实验测定Smad4或Runx2特异性siRNA非病毒载体对切断大鼠跟腱诱导异位骨化动物模型的影响:实验组行跟腱切断术和植入100μg的Smad4-siRNA或Runx2-siRNA重组非病毒载体,对照组行跟腱切断术和植入100μg的pcDNA4/HisA非病毒载体。10周后,行CT三位重建检测形成的异位骨大小,HE染色观察其组织形态。结果:1、在合成的3条Smad4-siRNA中,siRNA139-159对Smad4的抑制效果最明显,在合成的3条Runx2-siRNA中,siRNA1057-1077对Runx2的抑制效果最明显。2、成功构建重组非病毒载体,转染原代成骨细胞可明显抑制Smad4和Runx2的表达。3、CT三位重建显示,Smad4-siRNA实验组形成的异位骨体积较对照组减小92%,Runx2-siRNA实验组形成的异位骨体积较对照组减小93%,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:Smad4和Runx2两种信号通路的特异性siRNA可以明显抑制切断跟腱诱导的异位骨化,但两种不同siRNA的抑制效果无差别。

摘要：目的:筛选Runx2特异性siRNA,优化反应条件,抑制MC3T3-E1细胞的成骨分化,探讨异位骨化基因治疗的新思路。方法:使用Ambion公司提供的网上工具,设计5条针对小鼠Runx2的mRNA的模板,用体外转录合成法合成5条siRNA;采用RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白质两个水平,在培养的MC3T3-E1成骨前体细胞中筛选有明显抑制作用的siRNA,并优化反应条件。将筛选出的siRNA转染成骨细胞,在不同时间点检测成骨细胞相关基因I型胶原、骨桥蛋白、骨钙蛋白、骨涎蛋白mRNA的表达,采用碱性磷酸酶活性分析检测碱性磷酸酶活性的变化。结果:在合成的5条siRNA中,siRNA1657-1677对Runx2的抑制效果最明显,最佳反应条件是:浓度80nM、脂质体/siRNA为1∶1、转染时间为72小时。采用RNAi技术抑制Runx2的表达可以抑制成骨相关基因如I型胶原、碱性磷酸酶、骨桥蛋白和骨钙蛋白等的表达,阻止成骨细胞分化。结论:Runx2特异性siRNA可以抑制成骨细胞分化,可用于异位骨化基因治疗的实验研究。

摘要：背景:小干涉核糖核酸是核糖核酸干涉的起始诱导物,在细胞内引起强烈的核糖核酸干涉,降解目的基因的信使核糖核酸,以控制目的基因表达。目的:利用核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸抑制软骨细胞中肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β诱导的核因子κB的活性及其基质金属蛋白酶9的表达,观察在软骨细胞中核因子κBp65与细胞因子的关系。设计、时间和地点:单一样本观察,细胞学体外实验,于2006-09/2007-09在北京大学医学部中心实验室完成。材料:SD大鼠关节软骨细胞。方法:利用质脂体将筛选优化好的核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸转染软骨细胞,特异性抑制核因子κBp65的表达,继而抑制肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β诱导的核因子κB的活性及基质金属蛋白酶9的表达。主要观察指标:利用电泳迁移率试验检测核因子κB的活性,反转录聚合酶链反应和蛋白质免疫印记法分析从信使核糖核酸和蛋白质两水平检测基质金属蛋白酶9的表达。结果:核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸抑制核因子κBp65的表达,降低肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β诱导的核因子κB的转录活性,抑制肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β诱导的基质金属蛋白酶9的表达。结论:在软骨细胞中核因子κBp65与肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β关系密切。

摘要：目的:构建核因子-κB(NF-κB)p65特异性小干涉核糖核酸(small interference RNA,siRNA)重组腺病毒载体。方法:设计特异性NF-κBp65siRNA的靶序列对应的双链DNA,插入腺病毒穿梭质粒,然后跟腺病毒骨架质粒共转染HEK-293A细胞,穿梭质粒和骨架质粒在细胞内整合包装重组腺病毒并用β-Gal染色鉴定。重组腺病毒扩增、纯化、滴度测定后,感染培养的大鼠关节软骨细胞,应用RT-PCR在mRNA水平观察NF-κBp65的表达。结果:β-Gal染色显示重组腺病毒载体构建成功,RT-PCR结果显示重组腺病毒有效抑制了目的基因NF-κBp65的表达。结论:特异性NF-κBp65 siRNA的重组腺病载体可以抑制目的基因的表达,可以用于体内抑制骨关节炎的实验研究。

摘要：康复医学作为一个临床医学学科相对于其他学科起步较晚、发展时间短,但是在近30余年康复医学已经从无到有,并逐渐发展成一个成熟的学科[1]。由于社会的发展、社会劳动结构的改变、社会的老龄化、疾病谱的改变、急诊救治率的提高等都对康复医学提出了更多和更高的需求[2—3]。＂5.12＂四川特大地震发生后,党和政府高度重视地震伤员的康复工作,提出＂用任务带动学科发展＂的要求。