摘要：ADP葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)是淀粉合成起始的关键酶,利用保守序列设计简并引物,得到一条橡胶树AGPase大亚基的类似序列,再以木质部cDNA为模板通过RACE(Rapid amplification of cDNA ends)技术克隆得到AGPase基因的cDNA全长,命名为HbLSUI(GenBank NO:KJ020930)。生物信息学分析结果表明,AGPase基因所编码的蛋白具有AGPase大亚基保守结构域。RT-PCR表达分析结果表明,AGPase基因在木质部和树皮中的表达量较高。利用荧光定量PCR分析AGPase基因在不割胶、常规割胶和乙烯刺激割胶3种割胶强度下的表达情况,结果表明,割胶和刺激割胶可导致该基因的表达量降低。

摘要：【目的】MYB转录因子是调控植物木质素合成和次生壁形成的重要转录因子之一。本文分离克隆到一个与拟南芥AtMYB20高度同源的橡胶树MYB转录因子基因HbMYB20,并在拟南芥中对其功能进行研究,以期了解其在橡胶树木质素合成和次生壁发育的分子调控中的作用,为橡胶树木材形成的分子调控机制研究及其遗传改良奠定基础。【方法】采用blast分析从树皮转录组中筛选出与拟南芥AtMYB20序列同一性较高的橡胶树MYB基因HbMYB20;设计ORF区特异性引物,以树皮c DNA为模板进行扩增得到该目的基因cDNA序列。实时荧光定量PCR检测该基因在橡胶树叶片、胶乳、茎干以及木质部与韧皮部的相对表达量。构建HbMYB20过表达植物载体,使用农杆菌蘸花法转化拟南芥,获得该基因过表达转基因株系。采用乙酰溴法和间苯三酚染色法,分析转基因、野生型拟南芥茎的木质素含量以及木质素在拟南芥茎基部横截面中的分布。对转基因、野生型拟南芥茎基部横截面切片进行甲苯胺蓝染色,并测量分析导管、木质纤维和维管束间纤维细胞的细胞壁厚度。最后,采用实时荧光定量PCR分析转基因及野生型拟南芥木质素和纤维素合成相关酶基因的表达。【结果】克隆得到1个橡胶树MYB转录因子基因HbMYB20,该基因开放阅读框(ORF)为927 bp,编码309aa的蛋白,氨基酸序列分析显示,HbMYB20与AtMYB20/43和AtMYB85/42同源性较高,属R2R3MYB转录因子G8亚组成员。表达分析显示HbMYB20在橡胶树茎干和木质部中高表达,胶乳中表达最低。对HbMYB20过表达拟南芥分析显示,该基因在3个转基因株系中均表达;相对野生型拟南芥,转HbMYB20拟南芥植株生长抑制,木质部和维管束间纤维的木质素染色面积较少、染色程度变浅,茎的木质素含量和木质纤维、导管及维管束间纤维的细胞壁厚度均显著低于野生型;同时转基因株系中木质素合成关键酶基因4CL1和CCoAOMT的表达量以及纤维素合成关键酶基因CesA8的表达显著下调。【结论】橡胶树MYB转录因子G8亚组成员HbMYB20,在茎和木质细胞中高表达。拟南芥中过表达HbMYB20导致转基因植株的矮小,细胞壁变薄,阻碍木质部中木质素的合成和积累,同时木质素和纤维素合成相关酶基因的表达显著下降。由此推测HbMYB20对拟南芥的木质素和纤维素合成都具有负调控作用,可能是1个橡胶树次生壁发育的负调控因子。