摘要：目的观察Cas9 RNP技术制备B2M和PD-1双基因敲除的人原代T淋巴细胞(以下简称T细胞)的效率。方法设计单向导RNA(sgRNA)后克隆至载体质粒,经转染HEK293T细胞后筛选出高效率的sgRNA;先后构建B2M及PD-1单基因敲除及同时敲除双基因的T细胞,分别通过Sanger测序、TA克隆及流式细胞术等方法验证编辑效率。结果成功构建包含sgRNA的载体质粒并经初筛获得高效率的B2M sgRNA1及PD-1 sgRNA1;在T细胞中验证B2M和PD-1单基因敲除效率均高达90%;构建双基因敲除T细胞后经验证基因层面的编辑效率高达90%,B2M及PD-1蛋白的表达下调率分别达86%、89%。结论利用Cas9 RNP技术可制备B2M和PD-1高效率双基因敲除的T细胞。