摘要：目的建立基于逆转录重组酶介导核酸扩增技术(RT-RAA)快速进行乙脑病毒(JEV)分型鉴定方法。方法根据乙脑病毒NS1基因设计通用型引物和探针,针对E基因分别设计Ⅰ型和Ⅲ型JEV特异性引物和探针,建立JEV RT-RAA检测方法,并分别对其灵敏度、特异性和重复性进行测试。结果建立的方法检测时间短(<20 min),与登革病毒、基孔肯雅病毒、黄热病毒、寨卡病毒及无交叉反应,检测灵敏度可达100拷贝/μl,JEVⅠ检测体系的灵敏度可达10拷贝/μl;方法的重复性好。结论建立的JEV分型鉴定RT-RAA方法快速、特异、灵敏,适用于口岸现场JEV的快速检测。

摘要：目的本研究建立了基于逆转录重组酶介导核酸扩增技术(RT-RAA)快速鉴定登革病毒血清型的方法。方法选取登革病毒基因组NS1基因片段分别设计DV I型、DVⅡ型、DVⅢ型和DVⅣ型引物和探针,建立登革病毒血清型鉴定RT-RAA检测方法,并分别对其灵敏度、特异性和重复性进行测试。结果建立的方法检测时间短(<30min),与基孔肯雅病毒、黄热病毒、寨卡病毒、乙型脑炎病毒等黄病毒属病毒及DV不同血清型间无交叉反应,检测的灵敏度可达102copies/μl,试验的重复性好。结论建立的登革病毒血清型鉴定RT-RAA方法具有快速、特异以及灵敏的特点,为探究登革病毒是否本土化,确定登革病毒分子流行病学趋势提供技术支持。

摘要：为了利用多分子伴侣表达载体在大肠埃希氏菌中融合表达人干扰素（IFNα）-2b，并进行IFNα-2b纯化工艺研究，试验采用人工设计并合成Smt3-IFN（x-2b克隆至自行构建的P32-TrxA载体中，将重组表达质粒P32-TrxA—Smt3-IFNα-2b转化至大肠埃希氏菌（***）BL21（DE3），经IPTG诱导表达、SDS—PAGE分析，在此基础上利用金属螯合层析、SUMO蛋白酶酶切、阴离子交换层析以及凝胶层析建立了IFNot-2b的纯化工艺。结果表明：重组质粒经酶切鉴定及测序证明构建正确；融合蛋白分子质量约为40ku，主要以可溶形式表达，表达量占菌体总蛋白的30％以上；纯化的IFNα-2b分子质量约为17ku，蛋白纯度达到95％以上，利用细胞病变抑制法测得干扰素的效价为1．0×10^8IU／mg。说明成功在大肠埃希氏菌中表达并经过简易工艺纯化了重组蛋白IFNα-2b。

摘要：目的制备含有7种血清型肉毒毒素切割位点(SNAP25-VAMP)的特异性绿色荧光融合蛋白,在***中诱导表达,纯化后用于肉毒毒素活性测定。方法根据SNARE蛋白复合物中SNAPE25和VAMP基因序列及各血清型肉毒毒素(Bo NTs)的切割位点,设计合成含有SNAREs中突触小体(SNAP25)和突触小泡膜蛋白(VAMP)的Bam HⅠ-HIS6-SNAP62-Eco RⅠ-VAMP57C-TAA-HindⅢ(以下简称为SV)基因,连接至p ET-28a-GFP载体上,构建重组质粒p ET-28a-GFP-SV,转化感受态*** BL21(DE3),IPTG诱导表达后,经DEAE阴离子交换层析、Cu2+金属螯合层析、Q阴离子交换层析3步纯化,BCA法测定纯化产物的蛋白浓度,ELISA法检测B型肉毒毒素轻链蛋白(Bo NT/BL)活性。结果构建的质粒p ET-28a-GFP-SV经双酶切及测序鉴定证明构建正确,表达的GFP-SV融合蛋白相对分子量约40 000,主要以可溶形式存在,蛋白浓度为18.4μg/μl,纯度可达70%以上。利用该融合蛋白的荧光强弱变化可测定Bo NT/BL活性大小,同时也可测定其抗体中和活性大小。结论制备的含有SV的特异性绿色荧光融合蛋白在***中获得了高效表达,为后续各型肉毒毒素活性检测及抗体中和毒素活性检测奠定了基础。

摘要：为了建立一种Klenow(exo-)蛋白的制备方法,并对其在RAA(recombinase-aid amplification)技术中的应用进行初步研究,通过Overlap点突变法构建获得目的基因片段,并构建Klenow(exo-)蛋白表达载体进而转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行诱导表达。表达产物通过Ni-NTA螯合层析进行初步纯化,然后用Heparine柱层析进一步纯化,通过SDS-PAGE鉴定纯化产物,获得了纯度较高的目的蛋白。用纯化后的目的蛋白配制RAA反应体系,针对肉源实际样本设计突变位点进行检测。实验结果显示该体系具有较强的特异性,在模板基因序列3′端出现双碱基差异时不会进行有效扩增,相较于常规的PCR检测方式该体系能够实现双碱基差异位点的有效区分。该技术未来有望大规模应用于SNPs的检测。