摘要：人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)已被发现60余年。在经历了20世纪60年代RSV疫苗研发失败后,基于融合前融合糖蛋白(prefusion fusion glycoprotein,preF)的RSV结构性疫苗目前已取得突破性进展,通过接种孕妇和60岁以上老年人群,为新生儿及老年人群提供有效保护,从而解决了预防RSV感染“无苗可用”的历史难题。2023年是RSV疫苗研发的里程碑,也将成为新的起点。在此背景下,本文系统介绍了RSV疫苗研发进展、面临的挑战及今后的发展方向,提出针对RSV不同易感人群应采用不同疫苗形式的科学依据及对策,并对RSV感染重点人群(如血清学阴性婴幼儿等低龄儿童)的疫苗研发难点及候选疫苗形式进行了全面分析。结合基于RNA病毒反向遗传学技术的RSV减毒活疫苗(live-attenuated vaccine,LAV)研发设计、临床试验数据及黏膜疫苗优势,笔者认为RSV LAV是预防6个月及以上婴幼儿和低龄儿童RSV感染的前景较好的候选疫苗,有望为RSV疫苗研发带来新突破。此外,本文就如何加强我国RSV疫苗研发提出建议。

摘要：目的构建可表达人呼吸道合胞病毒(RSV)转录延长/终止抑制因子M2-1(简称M2-1)、核蛋白(N)、磷蛋白(P)和大蛋白(L)的真核表达载体并鉴定蛋白表达情况。方法采用合成T7启动子Oligo DNA及PCR方法获得含有T7启动子的表达盒,通过体外连接方法克隆入载体px8δT,制备表达载体px8δT-PT。设计3对PCR引物,PCR扩增出RSV的M2-1、N和P基因,并克隆至px8δT-PT,构建px8δT-PT-M2-1、px8δT-PT-N和px8δT-PT-P。同时利用已有的质粒pcDNA3.1-L构建px8δT-PT-L。用重组质粒转染BSR T7/5细胞,72 h后再用Western blot法鉴定蛋白的表达。结果成功实现px8δT的改造,构建的4种重组质粒px8δT-PT-M2-1、px8δT-PT-N、px8δT-PT-P和px8δT-PT-L,经限制性内切酶分析与预期一致,经Western blot法分析证实M2-1、N及P蛋白被表达。结论获得以T7为启动子的表达载体px8δT-P,成功构建了含有M2-1、N及P编码基因的表达载体,为利用反向遗传学技术进一步改造RSV奠定了基础。

摘要：根据编码增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的开放读码框(open reading frame,ORF)设计引物,PCR方法扩增出5'端带His标签的EGF PORF,利用杆状病毒表达系统构建表达EGFP基因的重组杆状病毒DNA分子,转染sf9细胞。取细胞培养上清进一步感染sf9细胞,荧光显微镜下观察EGFP蛋白的表达,Ni柱亲和层析纯化表达的EGFP蛋白,并将纯化后的EGFP用于EGFP特异性体液分析。结果显示成功克隆了EGF PORF,荧光显微镜观察到重组杆状病毒表达的EGFP,Ni柱亲和层析可获得纯度达90%的EGFP蛋白,纯化后的EGFP蛋白仍然具有良好的免疫原性,能作为包被抗原分析体液免疫效果。利用杆状病毒表达系统制备EGFP,具有产量高、纯化方便及生物活性好的特点。

摘要：目的:利用单个突变引物,在含人呼吸道合胞病毒F蛋白基因编码序列的pc DNA3.1(+)-F质粒中,通过单次环形PCR在特定序列位置引入定点突变。方法:以双链环状的pc DNA3.1(+)-F质粒DNA为模板,设计分别含有三种目的突变N70Q,I431N,Q270T的三条单引物,分别进行单次PCR。用甲基化DNA特异的限制性内切酶Dpn I处理PCR产物后转化大肠杆菌DH5α,进行克隆筛选,酶切鉴定和测序分析。结果:酶切鉴定结果和测序结果均符合预期,利用单引物PCR法成功在含人呼吸道合胞病毒F蛋白基因编码序列的pc DNA3.1(+)-F质粒DNA中引入了单碱基突变、两个间隔碱基突变及相邻三碱基突变三种目的突变。结论:单引物PCR法解决了常规定点突变方法中多个PCR反应,程序繁琐及突变效率低等问题,是一种简便、快速、有效的基因工程定点突变新方法。

摘要：目的:建立一种基于DNA Assembly方法的重组腺病毒载体构建方法。方法:首先,通过设计合适的酶切位点及同源臂,采用了传统的限制性内切核酸酶连接方法和DNA Assembly方法获得63型猩猩腺病毒(Chimpanzee adenovirus serotype 63,ChAd63)的骨架质粒pChAd63。随后,采用Sca I单酶切携带EGFP基因的穿梭pShuttle63/EGFP,Hpa I单酶切pChAd63,以DNA Assembly方法,获得重组腺病毒载体pChAd63/EGFP。最后,在293细胞中拯救获得重组腺病毒rChAd63/EGFP。结果:采用DNA Assembly方法成功构建了重组腺病毒载体pChAd63/EGFP,并拯救出重组腺病毒rChAd63/EGFP。结论:DNA Assembly可用于重组腺病毒载体的构建,有利于提高重组腺病毒载体的构建效率。

摘要：目的:以T7启动子表达系统为基础,通过RNA病毒反向遗传学操作,拯救人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)微型基因组。方法:构建可分别表达RSV四种核壳体蛋白的辅助质粒px8δT-PT1-N,px8δT-PT1-P,px8δT-PT1-M2-1和px8δT-PT1-L以及含增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorecent protein,EGFP)开放读码框(open reading frame,ORF),RSV病毒前导序列(leader region/genomic promotor),转录起始信号(gene start,GS)、转录终止信号(gene end,GE)和尾随序列(trailer region/antigenomic promoter)等顺式作用元件(cis-acting elements)的微型基因组重组质粒pSC11-E,在上述的5个质粒中,均引入T7 RNA多聚酶(T7 RNA polymerase,T7 RNP)启动子,经鉴定正确后,先以pSC11-E转染RSV感染的可组成型表达T7多聚酶的BSR T7/5细胞进行拯救,确定微型基因组编码质粒设计的合理性,而后通过5个质粒共转染BSR T7/5细胞,并通过荧光显微镜观察荧光的表达情况判断拯救成功与否。结果:成功构建了基于T7启动子表达系统的RSV微型基因组5质粒拯救系统,并实现了拯救。结论:该系统的成功构建,有助于今后对RSV病毒开展基因修饰研究。

摘要：目的研究人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial viruse，RSV）分泌型融合蛋白（secreted fusion protein，sV）基因在杆状病毒中的表达及纯化。方法根据编码F蛋白的基因序列设计引物，以PCR方法将F蛋白基因的跨膜区和胞质区核酸序列替换为6×His核酸序列，获得COOH’端带有His标签的重组SF-His蛋白编码基因，利用Bac—to—Bac杆状病毒表达系统，构建可表达sF蛋白的重组杆状病毒，用脂质体Cellfeetine reagent转染sf9细胞，实现sF在sf9细胞中的表达，Ni柱亲和层析纯化sF蛋白。结果成功获得了sF-His编码基因，构建的重组杆状病毒可高效表达sF，Ni-柱纯化后sF的浓度为1．084mg／ml，纯度达90％以上。结论杆状病毒系统是制备sF的有效方法，纯化的sF蛋白为RSV新型疫苗及单克隆抗体和诊断试剂等研究奠定了基础。