摘要：以含取代基团的苯酚和氯代环氧丙烷为原料,经多步反应合成了4种含芳香结构的化学修饰单体,针对靶向Mdm2 mRNA序列的siRNA,在其3'末端加入不同化学修饰的单体制备获得9个siRNAs.采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法对所合成的siRNAs进行体外抗肿瘤活性、稳定性测试,结果显示化学修饰的siRNA8,siRNA11,siRNA15对人乳腺癌MCF-7细胞的活性和核酸酶稳定性均有显著提高,其中siRNA11体外对RNA水解酶的半衰期提高了10倍.

摘要：目的构建一种可同时表达靶向两种基因shRNA的瞬时表达载体,以提高RNA干扰效率和降低载体的非特异毒性。方法载体采用pUC19的质粒基本序列,RNA聚合酶III识别的H1启动子,并利用同尾酶的特性设计两个多克隆位点,用DNA重组技术构建了载体pCSH1;以pCSH1为基础,构建靶向N-Ras或c-Myc的单干扰载体,以及靶向N-Ras和c-Myc的双干扰载体,并验证其干扰效率;并用克隆形成法验证了载体的抗肿瘤活性;此外还将靶向N-Ras两个shRNA转录单位串联到一个载体中,检测该连接方式的优势。结果成功设计并构建了可同时表达双基因shRNA的瞬时表达载体pCSH1。对该载体的验证结果表明,靶向N-Ras的单干扰shRNA表达载体pCSH1-shNR或靶向c-Myc的单干扰shRNA表达载体pCSH1-shMyc对靶基因mRNA和蛋白具有明显的干扰作用;双干扰载体pCSH1-shNM也能同时抑制N-Ras和c-Myc的mRNA和蛋白表达水平,且对细胞克隆形成的抑制率最高。细胞生长曲线法检测两个N-Ras-shRNA表达单位串联的载体pCSH1-2shNR对细胞生长的抑制作用,结果显示在质粒质量相同条件下,双表达载体pCSH1-2shNR对细胞的生长抑制作用显著强于单N-Ras-shRNA表达载体pCSH1-shNR,而相同质量的对照质粒pCSH1-2shMock、pCSH1-shMock对细胞生长的抑制没有明显差异。结论利用同尾酶原理构建了一个可同时表达双shRNA的瞬时表达载体pCSH1,该载体可实现双基因同时干扰;pCSH1还具有分子量小、shRNA表达单位可以串联和串联后RNA干扰活性增强的优点。该载体通过同时抑制两个靶基因或增加对单个靶基因的shRNA表达单位可以取得更好的抗肿瘤活性。

摘要：目的构建一种靶向MR-1基因的shRNA稳定表达载体,并检验其对白血病K562细胞增殖能力的影响。方法以带有H1启动子可稳定表达靶基因shRNA的pCD-shRNA为载体,采用BamHI和HindIII酶切pCD-shRNA并回收线性空载体,采用T4DNA连接酶将MR-1shRNA模板DNA双链与酶切后线性化的载体连接,从而建立稳定表达MR-1-shRNA的载体。将构建的pCD-shRNA-MR-1载体转染人白血病K562细胞,建立稳定沉默MR-1的细胞系,采用细胞计数法和westernblot对MR-1沉默后细胞的增殖能力和信号通路进行检测分析。结果成功构建了可稳定表达MR-1-shRNA的载体pCD-shRNA-MR-1,经酶切鉴定及基因测序测定,结果表明载体中的MR-1-shRNA与设计序列完全相符,目的基因序列准确无误。将pCD-shRNA-MR-1转染白血病K562细胞,建立了两株稳定沉默MR-1的K562/MR-1细胞株。细胞增殖实验表明,MR-1稳定沉默细胞的增殖能力显著降低;细胞信号通路结果表明,MR-1稳定沉默细胞Jak2和Bcr-Abl的磷酸化水平降低。结论利用pCD-shRNA质粒构建了一个可表达MR-1-shRNA的表达载体,该载体转染K562细胞后引起细胞增殖能力降低。研究表明MR-1基因在肿瘤细胞增殖过程具有促增殖作用,其机制是降低Jak2和Bcr-Abl的磷酸化水平。