摘要：目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立巴马小型猪胚胎成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)α-1,3-半乳糖基转移酶(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)/β-1,4 N-乙酸氨基半乳糖转移酶(β-1,4 N-acetylgalactosaminyltransferase,β4GalNT2)双基因敲除细胞系,为构建α-1,3-半乳糖(α-1,3-galactose,α-Gal)和SD(a)抗原缺失的巴马小型猪模型奠定基础。方法分别选取猪GGTA1基因的第三外显子和β4GalNT2基因的第八外显子为敲除靶点,利用在线工具(http://***)设计并合成单导向RNA(single guide RNA,sgRNA),以含有Cas9基因的pX330质粒为骨架构建打靶载体,转染野生巴马小型猪的PFFs,用T7EN1酶切验证打靶载体敲除效率。将打靶载体与G418抗性质粒(tdTomato)共转染巴马小型猪PFFs,经药物筛选获得阳性单细胞克隆后测序鉴定基因型。结果成功构建靶向GGTA1和β4GalNT2基因的Cas9/sgRNA表达载体。转染PFFs后用药物筛选得到31个单克隆细胞系,其中5个为GGTA1/β4GalNT2双基因敲除的细胞系。结论Cas9/sgRNA表达载体可以高效编辑PFFs的GGTA1/β4GalNT2基因并获得了双基因敲除的单细胞克隆,为构建GGTA1/β4GalNT2敲除的巴马小型猪提供必需的实验材料。

摘要：目的:利用CRISPR/Cas9技术建立五指山小型猪近交系GGTA1/β4GalNT2双基因敲除克隆猪。方法:设计合成靶向猪GGTA1和β4GalNT2基因的单导向RNA(single guide RNA,sgRNA),以pX330质粒为骨架,分别构建GGTA1和β4GalNT2的Cas9打靶载体,转染至近交系五指山小型猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF)中,通过G418药物筛选和测序鉴定获得双基因敲除的单细胞克隆,然后利用体细胞克隆技术(somatic cell nuclear transfer,SCNT)获得双基因敲除的近交系五指山小型猪,并利用流式细胞技术检测克隆猪外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中αGal和Sd(a)抗原的表达。结果:成功构建GGTA1和β4GalNT2基因的Cas9/sgRNA表达载体,转染后获得双基因敲除的近交系五指山小型猪PFF细胞克隆9个。SCNT成功获得了10只五指山小型猪近交系双基因敲除的克隆猪,其PBMC无αGal和Sd(a)抗原的表达。结论:CRISPR/Cas9技术可以实现对猪GGTA1/β4GalNT2基因的编辑。本实验首次成功制备了GGTA1/β4GalNT2双基因敲除的近交系五指山型猪,为异种器官移植研究与应用提供了新的供体材料。