摘要：目的研究DNA型外部引导序列对人巨细胞病毒(HCMV)UL97基因的靶向抑制作用及抗病毒作用。方法借助计算机软件(RNAStructure4.5)模拟HCMV UL97 RNA的结构,选择二级结构相对简单且具备核糖核酸酶P(RNase P)底物一级结构序列特征的位点作为候选切割靶位,针对不同靶位设计并合成的DNA型EGS。将各EGS分别与体外转录的HCMV UL97 RNA及纯化的人RNase P体外混合,初步筛选具备靶向引导切割活性的EGS。进一步将体外有效的EGS转入HCMV感染的人胚肺成纤维细胞(HELF),通过Western与Northern印迹法检测EGS在宿主细胞内对靶基因表达的影响。此外,通过空斑试验测定病毒的生长曲线,测定EGS对病毒复制的影响。结果本文设计并合成了针对HCMV UL97基因6个不同靶位的DNA型EGS(EGS_(168)、EGS_(212)、EGS_(313)、EGS_(663)、EGS_(1580)和EGS_(1664))。体外切割试验证实,EGS_(212)、EGS_(313)、EGS_(663)和EGS_(1580)具有明显的靶向引导切割作用。在HCMV感染的宿主细胞中,EGS_(212)和EGS_(1580)均能够沉默病毒UL97基因的表达,并显著抑制病毒的复制,分别使病毒滴度降低高达约300倍和600倍。结论本研究成功获得两种具有抗HCMV潜力的DNA型EGS,为进一步研发新型抗HCMV核酸类药物奠定了基础。

摘要：目的针对禽流感病毒(AIV)复制酶PB2亚基的基因构建具有靶向切割作用的M1GS核酶,为新型抗AIV反义药物的开发奠定基础。方法基于大肠埃希菌的核糖核酸酶P(RNase P),根据AIV PB2基因的序列特征,设计一小段与之互补的引导序列GS,通过PCR技术将其共价连接至大肠埃希菌RNase P催化性亚基(M1 RNA)的3'末端,以构建靶向性M1GS核酶。通过体外切割试验测定M1GS核酶的活性。结果构建了M1GS-T_(436)、M1GS-C_(341)两种M1GS核酶。体外切割实验证实,核酶M1GS-T_(436)可对靶RNA片段产生特异性切割;核酶M1GS-C_(341)虽可切割靶RNA片段,但可能属于非特异性切割。结论成功构建并筛选出一种具有显著体外切割活性的M1GS核酶(M1GS-T_(436)),为今后进一步研究其胞内及体内抗病毒活性奠定了基础。

摘要：目的基于丙肝病毒(HCV)基因组保守区5'UTR的序列,设计一段相应的外部引导序列(EGS),鉴定其体外靶向切割活性及胞内抗病毒作用。方法用计算机软件对HCV基因保守区的5'非翻译区(5'UTR)序列与结构进行分析,选择针对HCV第67位胞嘧啶C与第68位鸟嘌呤G之间的位点,作为设计的靶位,设计相应的EGS(EGS-C^(67)),将该EGS导入HCV感染的Huh7.5.1细胞,通过Northern blot及Western blot试验检测HCV基因的表达,通过荧光定量PCR检测EGS-C^(67)的抗病毒活性。结果体外切割试验表明EGS-C^(67)对HCV RNA片段具有明显的靶向引导活性。在宿主细胞内EGS-C^(67)可显著抑制HCV基因的表达,可使Huh7.5.1细胞培养上清中HCV的滴度降低约150倍(P<0.01)。结论 EGS-C^(67)作为一种新型抗HCV核酸分子,其成功构建为抑制HCV增殖提供了一种新的抗病毒策略。