摘要：低温脂肪酶在低温条件下仍具有较高活性,在食品添加剂、洗涤添加剂及有机合成等产业具有非常独特的应用前景。从低温菌株中分离低温脂肪酶基因是开发新的低温脂肪酶的有效手段。首先利用油脂同化平板与三丁酸甘油酯-维多利亚蓝平板从冰川土样中筛选分离获得一株具有较高脂肪酶活性的真菌,18S rDNA鉴定其属于青霉属,命名为Penicillium ***-9。根据真菌脂肪酶多序列比对获得的保守区,设计简并引物,利用降落PCR与染色体步移的方法从Penicillium ***-9中克隆到2个完整的脂肪酶基因,分别记为LipA与LipB。LipA全长1 014 bp,无内含子,编码337个氨基酸。而LipB全长1 232 bp,cDNA长1 122 bp,含有2个内含子,编码373个氨基酸。将两基因的cDNA序列克隆到pET30a(+)载体上,转化大肠杆菌Escherichiacoli BL21(DE3)。经低温诱导表达后,LipA大部分表达为包涵体,包涵体经复性后具有脂肪酶活性,并表现出低温适应性;LipB则大部分表达为可溶性蛋白,Ni-亲和层析柱纯化后,其亦具有低温脂肪酶活性。青霉菌株XMZ-9的获得与低温脂肪酶的克隆表达研究,为研究低温菌株与低温酶的适冷机制提供了宝贵的资源,也为进一步开发利用低温脂肪酶奠定了基础。

摘要：不同细菌有不同的最适生长温度,而基因序列与其最适生长温度密切相关。为探究其相关性,选取92个具有不同最适生长温度的细菌的全基因组序列为研究材料,通过寻找92个细菌共有的同源蛋白,并计算共有同源蛋白中氨基酸的频率,发现共有同源蛋白的氨基酸频率特征与其最适生长温度存在着显著的相关关系,其中蛋白质序列中的螺旋结构与其最适生长温度关系最大。该研究为揭示细菌对温度的适应机制,以及对蛋白质稳定性相关的分子设计具有重要的意义。

摘要：对来源于Streptomyces olivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB进行同源建模和序列比较,设计了N13D、S40E的定点突变,以期改善中温酶XYNB的热稳定性。突变酶N13D、S40E分别在毕赤酵母中表达,经纯化后与野生型酶XYNB(同样经毕赤酵母表达后纯化)进行酶学性质比较,结果表明,突变酶N13D和S40E在70℃处理5min,热稳定性比XYNB分别提高了24.76%和14.46%;突变酶N13D的比活性比XYNB提高了22%。在其他性质方面突变酶N13D、S40E与野生型酶XYNB基本相似。通过对木聚糖酶XYNB的定点突变,提高了该酶的热稳定性,并为结构与功能的进一步研究提供了材料。

摘要：几丁质酶中存在结合口袋及水解活性位点,关键氨基酸与底物几丁质的结合可调控酶的水解活性。以嗜热几丁质酶Chi304为研究材料,采用同源建模分析其高级结构,发现在其底物结合口袋附近存在2个色氨酸(W140与W272),将其定点突变为丙氨酸后,采用高效液相色谱检测酶的水解产物,并进一步分析水解产物三乙酰壳三糖(DP_(3))与二乙酰壳二糖(DP_(2))的比例(DP_(3)/DP_(2)),用于评估突变体的效果。结果表明,突变体W140A、W272A与W140/272A水解胶体几丁质产物DP_(3)/DP_(2)分别较野生型提升23.3%、45.7%与80.0%。由此表明,W140与W272是影响酶与底物结合的关键氨基酸,将其突变为丙氨酸可提升Chi304的内切活力,降低外切活力。

摘要：糖苷水解酶(glycoside hydrolases,GHs)在各个行业广泛应用,其需求量不断增加.然而,如何提高酶的催化效率仍然是一个挑战.本文开发了基于深度神经网络和分子进化的策略(MECE)预测提高糖苷水解酶催化活性的突变体.作者首先从CAZy数据库中收集整理了119个糖苷水解酶家族的蛋白序列,建立了能够识别糖苷水解酶家族和功能残基的深度学习模型DeepGH,通过10倍交叉验证结果显示DeepGH模型的预测准确率为96.73%.随后利用梯度加权类激活图谱(Grad-CAM)方法提取分类相关特征,结合序列进化信息对突变体进行设计最后获得了具有7个氨基酸突变位点的壳聚糖酶突变体CHIS1754-MUT7.实验结果表明,CHIS1754-MUT7的k_(cat)/K_m是野生型的23.53倍.该策略计算效率高,实验成本低,具有显著的优势,为酶催化效率的智能设计提供了一种新的途径,具有广泛的应用前景.

摘要：全细胞生物传感器是一种以微生物全细胞为敏感元件,可以快速感应环境中的毒性物质及污染物的装置。因其具有响应快、体积小、成本低、可实现原位监测等优势,在环境监测、药品研发、食品工业等领域显示出巨大潜力。综述了全细胞生物传感器的原理、分类及其在环境污染物监测领域的应用进展等,并对其未来的发展趋势进行了展望,以期为全细胞生物传感器的开发与利用提供参考。

摘要：通过理性设计提高蛋白质的热稳定性一直是当今计算生物学及蛋白质工程领域中的一个研究热点。与传统的定向进化的方法相比,该方法具有目的性强、效率高的优点,对扩大蛋白质的应用范围与探究蛋白质结构和功能的关系均具有重要意义。本文详细介绍了影响蛋白质热稳定性的因素,以及一些常用的通过理性设计来提高蛋白质的热稳定性的策略。由于影响蛋白质热稳定性的因素众多,并且众多因素之间还具有千丝万缕的联系,到目前为止研究人员还没有提出一个公认的适合于所有蛋白质的理性设计的策略,这也是现代计算生物学家及蛋白质工程学家们努力研究的一个重要方向。

摘要：来源于苍白杆菌Ochrobactrum sp.M231的甲基对硫磷水解酶MPH-Och具有优良的催化水解甲基对硫磷农药的能力,针对其热稳定性较差的缺点,通过组合3种提高蛋白热稳定性的突变策略,最终获得热稳定性改良的突变酶MPHM7,其T50达到65℃,在之前研究热稳定性提高的四点突变酶(S274Q/T183E/K197L/S192M)的基础上又提高了5℃。同时,该突变酶的催化效率也获得了一定的提高,其kcat/Km值是四点突变酶的3.8倍。热稳定性改良突变酶的获得证实了这些提高热稳定性的方法是有效的,并且其作用具有加合性,这为分子设计改良酶蛋白热稳定性提供了新的研究思路。

摘要：分别自假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenesC2-1)和假单胞菌(Pseudomonassp.1-7)中克隆得到甲基对硫磷水解酶基因ophc2和ophc3,其编码甲基对硫磷水解酶OPHC2和OPHC3的氨基酸序列相似性达98.5%,仅5个氨基酸残基不同,但酶学性质差异很大,特别是对不同底物降解特性有很大差异。OPHC2对甲基对硫磷的催化效率是OPHC3的2.75倍,对乙基对硫磷的催化效率仅为OPHC3的12.9%。为了提高OPHC2对乙基对硫磷的降解活性,以OPHC3的序列为依据,针对5个不同的氨基酸设计正交实验,对OPHC2进行组合突变,最终获得了一个突变体P165S/A169V,对乙基对硫磷的催化效率是OPHC2的1.19倍,对甲基对硫磷的催化效率是OPHC2的1.36倍。

摘要：将来源于假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)的有机磷降解酶OPHC2进行了N端及内肽的氨基酸序列测定, 根据得到的氨基酸序列设计合成了简并引物, 通过PCR和反向PCR从Pseudomonas pseudoalcaligenes中克隆出有机磷降解酶基因ophc2. 编码基因全长975 bp, (G+C)含量为63%, 有一个可读框, 编码324个氨基酸, 酶蛋白理论分子量为36 kD. 编码基因的核苷酸序列分析表 明,与目前发表的有机磷降解酶基因相比同源性很低, 最高的只有46.4%, 说明这是一个新的有机磷降解酶基因. 将克隆得到的带有信号肽编码序列的和不带信号肽编码序列的有机磷降解酶基因, 分别与载体pET-30a构建重组表达质粒, 得到的表达产物具有正常的生物学活性.