摘要：根据GenBank中登录的肠出血性大肠杆菌保守基因序列Stx1、Stx2设计合成荧光定量PCR引物和探针,对荧光定量PCR的反应条件进行优化,建立了TaqMan荧光定量PCR检测方法。用建立的检测方法对临床分离病料进行了检测,并与常规PCR方法的检测结果做了对比。结果显示,建立的TaqMan荧光定量PCR方法的灵敏度达7.06×103CFU/mL,比常规PCR方法的灵敏度高106倍。用该方法和常规PCR对8种样品进行了检测,证实,该方法与常规PCR的阳性符合率为100%,具有较好的重复性。

摘要：根据LMO溶血素基因hlyA设计引物,PCR扩增hlyA,将扩增产物与pMD18-T连接,重组质粒经酶切鉴定、PCR分析以及确证性测序。将由重组质粒pMD18-hlyA上扩增的缺失信号肽序列的目的片段与表达载体DGEX-4T-1分别酶切连接后,转化BL21细胞。筛选阳性克隆,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析,纯化重组融合蛋白进行溶血试验、小鼠致病力试验和间接ELISA分析。结果表明hlyA基因在大肠杆菌中成功表达分子量82Ku的融合蛋白,能裂解红细胞,且能被LMO阳性血清所识别。一定剂量腹腔注射能将小鼠致死。以此为包被抗原的间接ELISA可以将LMO阴、阳性血清分开。这表明GST-LLO融合蛋白具有良好的生物活性,可用于李氏杆菌病的间接ELISA诊断。

摘要：根据口蹄疫病毒(FMDV)China99流行毒株基因序列设计特异引物,以阳性质粒pGEM-p1为模板,扩增p1基因。p1片段经Nco和Xho酶消化后,得到目的基因VP2-3-1,将其与经相同酶消化的表达载体pProEx-HTb连接并转化BL21(DE3),经PCR、酶切鉴定和序列分析筛选阳性克隆,经IPTG诱导后SDS-PAGE检测,结果表明VP2-3-1基因得到表达;Westernblotting结果显示,该表达蛋白能被口蹄疫病毒阳性血清所识别。

摘要：根据GenBank上马属抗菌肽hepcidin的氨基酸序列,设计并合成全长279bp的hepcidin基因,将该基因插入pPICZαA中构建真核表达载体,PCR鉴定的阳性质粒电转化毕赤酵母菌X-33,用不同浓度Zeocin筛选高拷贝阳性重组菌,甲醇诱导表达,表达上清液经超滤膜纯化后,利用SDS-PAGE电泳和抑菌试验进行鉴定.结果表明:PCR检测和基因测序表明hepcidin基因合成正确,成功构建真核表达载体pPICZαA-hepcidin;SDS-PAGE电泳显示,诱导表达hepcidin蛋白分子质量约10ku,超滤纯化后蛋白浓度达177.8mg·L-1;抑菌结果表明,该表达产物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、无乳链球菌均有较好的抗菌活性.

摘要：参照GenBank中牛支原体PG45株二氢硫辛酸脱氢酶基因(pdhD)的序列设计特异性引物,应用PCR扩增牛支原体武威株的pdhD基因,然后将其克隆至pMD19-T。在完成测序及点突变的基础上构建重组表达质粒pET-28a(+)-pdhD,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后纯化表达产物His-DLD,并对其酶促反应活性进行测定。结果显示,表达产物在底物NADH存在条件下,能将硫辛酰胺催化生成二氢硫辛酰胺,且其最适酶促反应温度为25℃、pH为7.5;其米氏常数Km(NADH)为9.72μmol/L,最大反应速率为25.6μmol/(L·min)。上述结果为研究二氢硫辛酸脱氢酶的生物学功能奠定了基础。

摘要：根据GenBank中公布的PRRSV基因序列(EU709837),设计一对PCR引物,以浙江分离株为模板,通过RT-PCR扩增出ORF5基因全序列。以PCR技术构建了缺失信号肽及三处跨膜区的重组ORF5基因,命名为g-ORF5。将g-ORF5基因定向克隆到原核表达载体pET-28a中,转化入***菌株BL21。经酶切和测序鉴定后,阳性菌株用1 mol/L IPTG诱导表达,用Ni-NTA纯化表达的重组蛋白。结果表明,重组GP5蛋白在大肠杆菌中获得表达。纯化后经ELISA和Dot-ELISA分析,表达蛋白具有免疫反应性,能与PRRSV阳性猪血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应。