摘要：目的通过RNA干扰(RNAi)阻断EJ细胞中survivin基因的表达,研究survivin基因沉默后对细胞生长和细胞凋亡的影响。方法将合成的DNA正义链及反义链变性、退火,形成的双链DNA与pSilencer2.0线性质粒以T4DNA连接酶连接,重组质粒经酶切、DNA测序鉴定后,用脂质体法转染EJ细胞,通过RT-PCR、免疫印迹检测干扰效果。MTT法检测细胞生长的影响,流式细胞仪检测转染后EJ细胞的凋亡变化。结果酶切及测序证实设计合成的DNA片段已正确插入载体。RT-PCR、免疫印迹检测实验表明:pSilencer2.0-SVV1、pSilencer2.0-SVV2重组载体均能有效地阻断EJ细胞中survivin基因的表达,使survivin基因在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调(P<0.01),后者抑制效果更佳。转染后的EJ细胞生长速度明显变慢。转染pSilencer2.0-SVV2实验组细胞的凋亡增加了17.0%。结论重组真核载体能有效抑制EJ细胞的survivin表达,抑制细胞的增殖,诱导细胞凋亡。

摘要：背景:间充质干细胞体内有限的存活能力严重制约其用于体内治疗方面的应用,因此寻找一种能延长存活能力的实验方法是间充质干细胞进行体内实验的重要前提。目的:应用***3d.P/hygro构建小鼠survivin基因的慢病毒表达载体。方法:采用Oligo核酸软件对Genbank上所发表的小鼠survivinmRNA序列进行分析,设计一对survivin基因上下游引物,利用Gateway克隆方法,分别在其两端添加attB重组位点,运用PCR扩增mSurvivin和IRES/EmGFP,将PCR产物进行BP反应然后转化到Stbl3感受态菌,通过卡那霉素抗性筛选、PCR鉴定,选取鉴定正确的pDown-mSurvivin和pTail-IRES/EmGFP克隆测序。将pDown-mSurvivin和pTail-IRES/EmGFP与***3d.P/hygro混合进行LR反应,构建慢病毒载体***3d.P/hygro-EF1A>mSurvivin>IRES/EmGFP,再次进行PCR、测序的鉴定。结果与结论:显示基因序列克隆正确,成功构建了含有小鼠survivin基因的重组慢病毒表达载体。说明慢病毒表达载体***3d.P/hygro-EF1A>mSurvivin>IRES/EmGFP构建成功,为下一步研究survivin在间充质干细胞中抗凋亡作用奠定基础。

摘要：背景:Survivin在多种肿瘤组织中的高表达,具有调节细胞增殖分裂和强大的抗凋亡功能。目的:利用RNA干扰技术,构建具有特异性阻断C57BL小鼠survivin基因的微小RNA(micro RNA,miRNA)表达载体。设计、时间及地点:单一样本观察,于2008-06/11在重庆医科大学附属第一医院神经内科实验中心完成。材料:环形pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR和BLOCK-iTTM PolII miR RNA干扰Expression Vector Kit with EmGFP为Invitrogen公司产品;DH5a大肠杆菌为实验室保存;xhoI和BamHI酶、壮观霉素均为上海生工生物工程有限公司产品。方法:应用设计软件在C57BL小鼠survivin基因的mRNA上寻找特异性的短核苷酸序列,并设计合成4对寡核苷酸序列,经退火后形成双链DNA片段,采用基因克隆技术,将其克隆到pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR的载体中,转化DH5a大肠杆菌,挑单菌落种于含有壮观霉素LB液体培养基中,提取质粒。主要观察指标:应用测序法和琼脂糖电泳检测对重组体进行鉴定。结果:测序结果显示插入片段与线性载体连接正确,无碱基突变、缺失、插入等异常。双酶切处理pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR重组质粒结果显示片段大小与预期相符。结论:实验结果表明成功构建了C57BL小鼠survivin基因的微小RNA表达载体。