摘要：背景:以往心肌梗死后心肌修复实验多集中于骨髓干细胞,甚少报道涉及富含造血干细胞、间充质干细胞及内皮祖细胞的脐血干细胞,而以其作为种子细胞的可行性及安全性尚未确定。目的:探讨人脐血单个核细胞移植对急性心肌梗死大鼠心功能和左室重构的影响。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-11/2007-09在中山大学动物试验中心完成。材料:脐血来源于足月分娩的健康产妇,由中山大学附属第一医院产科提供。Wistar雄性大鼠45只,随机分为假手术组、模型组、细胞移植组,15只/组。方法:采用羟乙基淀粉沉淀联合ficoll-paque密度梯度离心法体外分离培养人脐血单个核细胞,移植前细胞行BrdU标记。模型组、细胞移植组大鼠结扎冠状动脉左前降支建立急性心肌梗死模型,造模成功后,细胞移植组在梗死区周边注射脐血单个核细胞悬液,模型组注射DMEM培养基,培养4周。假手术组仅开胸并在左前降支下过线。主要观察指标:通过超声心动图评价心脏结构,以左心导管检测血流动力学改变,采用苏木精-伊红染色、Masson染色和BrdU免疫组化染色观察心肌组织病理学变化、心肌胶原含量变化及移植细胞存活情况。结果:与模型组比较,细胞移植组左室壁厚度增加,室壁活动度明显改善,左室舒张末期内径缩小,球形指数增大,左室舒张末压显著下降,左室内压最大上升/下降速率明显增快,差异均有显著性意义(P<0.05)。假手术组心肌细胞间仅见少量胶原纤维,呈条索状与心肌纤维平行排列;与模型组比较,细胞移植组心肌细胞肿胀程度及排列情况均有所改善,细胞移植组胶原容积分数明显降低(t=3.81,P=0.001)。模型组梗死区及其周边和假手术组均未检测到BrdU阳性细胞,细胞移植组胞核呈BrdU阳性的细胞散在分布于梗死区,部分阳性细胞参与到血管壁的组成。结论:在未使用免疫抑制剂的条件下,人脐血单个核细胞可成功移植到大鼠心肌梗死区,且短期内具有改善心功能、抑制梗死后心肌重构的作用。

摘要：目的:设计一种在上肢握力负荷的同时再增加下肢等长运动负荷方法即增强的等长运动负荷,并结合超声心动图对冠心病(CAD)进行初步研究,探讨其检测冠心病的价值。方法:采用自行研制的等长运动心脏负荷试验机对一组临床上疑似CAD的胸痛病例(45例)进行增强的等长运动超声心动图负荷试验及冠脉造影检查,并根据冠脉造影结果将上述45例患者分为CAD组和正常组。结果:(1)负荷后的血流动力学变化明显,心率、动脉收缩压、心率-收缩压乘积显著性增加;(2)诊断敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为79.3%、81.3%、88.5%、57.9%;(3)CAD组在负荷后左室舒张、收缩功能指标二尖瓣口血流E峰/A峰、LVEF明显低于负荷前以及正常组的负荷前、后(P<0.05)。结论:增强的等长运动超声心动图负荷试验方法对于CAD诊断的准确率较高,并可有效评价CAD患者舒张、收缩功能的变化,有推广应用价值。

摘要：目的扩增BMP2基因下游110kb处的预测有增强子功能的非编码序列,将其插入pGL3-promoter载体,构建该长片段的真核表达系统。方法在所设计的上下游引物的5’端加入BamHⅠ酶切位点,采用聚合酶链反应(PCR)的方法从短指畸形患者外周血提取的DNA中扩增BMP2基因下游区域预测有增强子功能的一段长约5kb的非编码序列。首先将扩增的目标片段与PGEM-T载体连接,连接产物转化DH5α感受态细菌,经蓝白斑筛选出的阳性克隆通过电泳、酶切鉴定后进行测序验证是否为插入的目标序列,测序正确后提取重组质粒。利用限制性内切酶BamHⅠ同时酶切插入目标序列的质粒和pGL3-promoter载体,将酶切完全的目标序列与线性pGL3-promoter空质粒载体在Solution I快速连接酶的作用下进行连接反应,构建目标序列的真核表达载体。结果经过酶切和测序证实含有4.8kb长的目标序列的分子克隆和真核表达载体构建成功。结论实验成功克隆了BMP2基因下游区域预测有增强子功能的一段长约5kb的非编码序列,并构建了pGL3-promoter-enhancer真核表达载体,为进一步验证该序列可能的调控功能奠定了基础。

摘要：目的建立乙型肝炎病毒YMDD突变的下一代测序法,并对此方法进行性能评价。方法采用离心柱法提取血清标本中的DNA,设计引物对乙型肝炎病毒P基因区扩增并靶向捕获,通过下一代测序技术对捕获的DNA进行检测,利用生物信息学分析软件系统对检测结果进行分析,得到基因突变结果,建立下一代测序用于乙型肝炎病毒YMDD突变的检测方法。收集慢性乙型肝炎患者血清样本共229例,采用下一代测序法和Sanger测序法同时检测YMDD基因突变,评价下一代测序法的检测性能。选取5例基因突变阳性的样本(包含不同基因突变型别)、2例基因突变阴性样本,采用下一代测序法对所选样本进行重复检测,评价该方法的重复性。结果建立了乙型肝炎病毒YMDD突变的下一代测序检测方法。对229份临床样本的检测中,2种测序方法均检测到74例(74/229,32.31%)YMDD突变,其中下一代测序法检测到44例(44/229,19.21%)rtM204V突变,25例(25/229,10.92%)rtM204I突变,5例(5/229,2.18%)rtM204V/I混合突变。Sanger测序法检测到47例(47/229,20.52%)rtM204V突变、25例(25/229,10.92%)rtM204I突变和2例(2/229,0.87%)rtM204V/I混合突变。下一代测序法检测到3例Sanger测序法漏检的rtM204V/I混合突变。与Sanger测序法相比,下一代测序法的灵敏度、特异度和准确度均为100%,突变类别完全符合率为95.95%(71/74),部分符合率为4.05%(3/74)。2种方法的一致性(κ)为0.97(P<0.01)。经重复性试验检测,下一代测序法的检测结果均一致,重复性符合率为100%。结论本研究建立的乙型肝炎病毒YMDD突变的下一代测序法灵敏度高,特异性好,重复性好,准确性高,比Sanger测序法更灵敏,能检测到更多的混合突变,为乙型肝炎病毒耐药基因检测提供了新的手段。