摘要：目的:制备血红素加氧酶-1(HO-1)融合蛋白PEP-1-HO-1,观察融合蛋白在大鼠H9c2心肌细胞的转导。方法:设计合成hHO-1 PCR引物,扩增hHO-1 cDNA片段;采用PCR靶向克隆法将扩增产物与含有相同酶切位点载体质粒pET15b-PEP-1进行重组,扩增质粒,双酶切鉴定和DNA测序;将测序和鉴定结果正确的重组质粒转化宿主菌Rosetta(DE3)pLysS,诱导表达融合蛋白PEP-1-HO-1,利用表达蛋白N端的组氨酸"标签"(His-tag)进行亲和层析纯化融合蛋白;SDS-PAGE和Western blotting对融合蛋白进行定性检测,Bradford法定量检测纯化后蛋白;融合蛋白孵育大鼠H9c2心肌细胞,免疫组化法观察融合蛋白在H9c2细胞的转导和分布,分光度法检测蛋白转导后的活性。结果:hHO-1 cDNA与pET15b-PEP-1重组成功,重组质粒pET15b-PEP-1-hHO-1经酶切鉴定含有hHO-1 cDNA,测序分析证实与GenBank提供的原始序列完全一致;重组质粒转化后经诱导和纯化得到了融合蛋白PEP-1-HO-1,浓度达到1.0 g/L;融合蛋白可以穿透H9c2心肌细胞胞膜,进入细胞后主要分布在胞质和胞核内并具有天然活性。结论:成功地构建了pET15b-PEP-1-hHO-1原核表达质粒,获得了可穿透H9c2心肌细胞膜的血红素加氧酶-1融合蛋白PEP-1-HO-1,为应用HO-1治疗缺血性疾病的研究奠定了基础。

摘要：目的:设计合成有效靶向Toll样受体4(TLR4)基因小干扰RNA(siRNA)表达载体,且挑选TLR4基因稳定沉默心肌细胞。方法:依据RNA干扰(RNAi)序列设计原则,以TLR4基因为靶基因,合成3对小发夹RNA(shRNA)寡核苷酸链,经退火、与线性化pSilence 2.1-U6neo质粒连接、酶切、测序并鉴定。脂质体法转染心肌细胞,新霉素(G418)加压筛选并收集稳定表达质粒的心肌细胞,并观察光镜下心肌细胞形态。RT-PCR及Western Blot法检测收集的心肌细胞TLR4mRNA和蛋白的表达,确定siRNA对TLR4的抑制效率。结果:测序鉴定插入发夹样序列正确,成功构建了TLR4基因siRNA表达载体;并获得了稳定沉默TLR4的心肌细胞。未见细胞毒性形态学改变。多种方法均证实siRNA作用于TLR4基因后,心肌细胞TLR4 mRNA和蛋白表达均被抑制,其中pSilence2.1-siTLR4-1抑制作用最强。结论:成功构建了靶向TLR4基因siRNA表达载体,并有效抑制心肌细胞TLR4表达。