摘要：传统的酶联免疫分析包括两次分子杂交,在临床检测等实际应用过程中耗时较长,增加了操作人员的劳动强度。通过基因工程构建一抗(单克隆抗体)和标记酶如辣根过氧化物酶(HRP)的融合蛋白,变两次分子杂交为一次分子杂交,即可大大缩短酶联免疫分析的时长。本研究以人胰岛素单链抗体(single chain variable fragment,scFv)基因和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)基因为模板,依据酵母密码子偏好性进行密码子优化、稀有密码子剔除、转录终止子类似结构消除等设计,合成了编码scFv-HRP重组融合蛋白的基因。该基因分别克隆至大肠杆菌表达载体pET28a与酵母遗传转化载体pGAPZαA。pET-scFv-HRP在*** BL21(DE3)中表达时(1 mmol/L IPTG,30℃,诱导2 h),其产率可达总蛋白的4.6%;在*** Rosette(DE3)中表达时(1 mmol/L IPTG,30℃,诱导2 h),未出现可见的诱导表达蛋白带。pGAP-scFv-HRP线性化后转化*** GS115,获得了12个阳性菌落。其中3株(4号,7号和8号)含有较高重组基因拷贝(依据博来霉素测试)。4号转基因酵母菌株摇瓶发酵后,对发酵液和细胞破碎后的上清液进行SDS-PAGE分析,在scFv-HRP理论分子量(63 kD)条带附近有明显的蛋白质条带出现。以抗纯化标签(6×His)抗体进行免疫印迹检测,该位置蛋白条带显示阳性。切下该位置蛋白条带后进一步进行串联质谱分析,结果表明该位置的蛋白条带含有重组蛋白scFv-HRP的片段且氨基酸残基序列一致。重组人胰岛素单链抗体和辣根过氧化物酶融合蛋白scFv-HRP的构建为后续建立胰岛素快速检测方法提供了重要材料基础。