摘要：以国际市场上转基因食品的主流产品转基因大豆及玉米和我国生产的转基因辣椒为材料 ,以PCR方法为基础 ,研究适用于转基因食品安全性检验的核酸检测技术。针对抗除草剂 (孟山都公司 )GM 大豆 ,转Bt 176玉米 (Novartis Ciba Geigy公司 )及转抗菌肽辣椒 (华农 )产品的插入基因及调控序列设计不同引物进行PCR检测。建立了转基因大豆、玉米、辣椒的鉴别和相关标记基因、目的基因检测的技术 ,该方法简便快速 ,检测结果与标准及申报材料相符。

摘要：目的建立TaqmanMGB实时荧光PCR技术快速检测登革病毒。方法利用TaqmanMGB技术，根据登革病毒3’端非编码区的一段高度保守序列，设计登革1～4型荧光PCR通用引物和TaqmanMGB探针，以登革热毒株作为标准，以乙脑毒株作对照，建立实时荧光PCR检测登革病毒的快速方法。并对8份ELISA法检测阳性的临床血清标本进行RT-PCR及荧光PCR扩增。结果RT-PCR检测8份临床血清标本，2份阳性，阳性率为25％。实时荧光PCR检测登革病毒cDNA灵敏度为0．17pg／μl，病毒液灵敏度为10^-5TCID50与乙脑病毒无交叉反应，检测8份临床血清标本，5份阳性，阳性率为62．5％。从RNA提取到检测结果仅需4h。结论TaqmanMGB实时PCR检测方法快速、敏感性高、特异性强，可作为登革病毒的快速检测方法，应用于登革热的临床早期诊断。

摘要：目的了解深圳市手足口病就诊情况及其病原学特征。方法发放统一设计的手足口病监测月报表,采用由医生填写调查表的方法,对2008-2010年深圳市某手足口病监测医院的门诊就诊病例和手足口病例分别进行统计;同时随机采集调查期间431例手足口病病例粪便标本,采用荧光逆转录-聚合酶链反应(reverse tran-scription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法进行病原学核酸检测。结果 2008-2010三年共有门诊就诊病例427 458例,其中手足口病10 355例,构成比为2.42%。4～10月份病例数较多;431例手足口病病例中,肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)阳性143例,阳性率为33.18%,柯萨奇病毒A16型(coxsackievirus A16,CoxA16)阳性78例,阳性率为18.10%。结论 2008-2010年手足口病就诊病例数占门诊病例数比例逐年增加,手足口病越来越受到人们的重视;2008-2010年深圳市手足口病的主要病原体为EV71,CoxA16的阳性率逐年下降。

摘要：目的:了解深圳市手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)疫情的病原学情况,为疫情的控制及病例的治疗提供可靠的实验室依据。方法:设计合成肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CA16)的型特异性引物,提取HFMD病例粪便标本中的核酸,采用RT-PCR方法扩增病毒的特异性片段,检测EV71和CA16核酸。结果:36起手足口病疫情中,13起由EV71引起,14起由CA16引起,构成比分别为36.11%及38.89%;各个行政区均有疫情发生,主要集中在人口密集流动性较大的罗湖区和南山区;疫情主要集中在4、5月份;99份标本中,EV71采样阳性率为28.28%,CA16采样阳性率为23.23%;EV71和CA16的采样阳性率没有显著性差异;不同性别间EV71和CA16的感染率没有显著性差异。结论:2008年深圳市HFMD疫情主要是由CA16和EV71引起,特别要加强对EV71引起的有中枢神经系统并发症的重症病例的监测。

摘要：目的 分析GⅡ-4型诺如病毒深圳分离株SZ2010422全基因组序列,了解其分子结构特点及进化特性.方法 根据New Orleans参考株全序列设计引物,用RT-PCR分段扩增诺如病毒全基因组,经分子克隆、测序后进行系统进化分析及衣壳区氨基酸位点分析.结果 GⅡ-4型诺如病毒深圳SZ2010422株病毒基因组全长7559 bp,病毒基因组分三个开放阅读框（ORFs）,ORF1、ORF2及ORF3长度分别为5100 bp、1623 bp和807 bp,ORF1与ORF2之间有19个核苷酸重叠.深圳株SZ2010422基因组核苷酸序列与参考株GⅡ-4型New Orleans变异株同源性最高,全长同源性为99.3％,ORFI、ORF2、ORF3同源性分别为99.5％、99.2％和98.6％.根据系统进化分析,深圳SZ2010422株属于GⅡ-4 New Orleans变异株.通过对衣壳区氨基酸比对,New Orleans变异株位点变化情况为：aa310N或K→S,aa341D→N,aa359T→S,aa396H→P,aa460H→Y.结论 诺如病毒深圳株SZ2010422属于GⅡ-4型New Orleans变异株.

摘要：目的通过克隆丙肝病毒非结构蛋白NS3-4A基因,构建表达HCV-NS3-4A基因的重组杆状病毒穿梭载体。方法设计合成HCV NS3-4A基因全长的特异性引物,应用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)扩增非结构蛋白区NS3-4A基因片段,经限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切后克隆到pFastbacDual上,并转化到大肠杆菌DH5α中,最后经PCR和双酶切鉴定转化菌落。结果扩增得到的基因片段长度为2.2kb,该片段成功克隆在杆状病毒穿梭载体pFastBacDual上,经测序证实为HCV NS3-4A基因,这表明HCV-NS3A基因重组杆状病毒穿梭载体构建成功。结论成功构建了表达HCV NS3-4A基因的杆状病毒穿梭载体,这将为下一步HCV杆状病毒载体疫苗的制备打下基础。

摘要：目的扩增丙型肝炎病毒核心区(HCV-Core)基因,并构建HCV-Core基因的重组表达载体。方法设计合成HCVCore基因全长引物,提取丙型肝炎患者血清中的HCV RNA,应用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)扩增C区基因片段,用限制性内切酶BamH1和SaL1双酶切后,连接到Pet32a表达载体中,并转化到BL21大肠杆菌中;然后PCR和双酶切鉴定转化菌落。结果扩增得到目的基因长度约600bp,经测序证实为HCV-Core基因,表明HCV-Core基因重组表达载体Pet32a-Core构建成功。结论成功构建HCV-Core基因表达载体Pet32a-Core,为下一步Core蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备奠定基础。

摘要：目的建立荧光定量RT-PCR技术用于检测手足口病的肠道病毒。方法利用TaqMan技术,设计一对共引物及探针,建立、优化反应体系后,构建质粒标准品,利用10倍稀释法建立相对定量标准曲线,根据TCID50倍比稀释,建立灵敏度曲线。特异性检验后利用临床标本与传统的RT-PCR法进行比较。结果定量标准曲线的灵敏度为105/μl(R2=0.999),PCR扩增效率为94%。灵敏度曲线显示检测到的最低浓度值为5.0TCID50/ml(R2=0.99),PCR扩增效率为97.6%。荧光RT-PCR检出率为80.9%,显著高于RT-PCR(检出率为62.92%)。结论研究建立的荧光定量RT-PCR方法检测肠道病毒敏感性高、特异性好、效率高,可以作为肠道病毒的快速检测方法。

摘要：目的建立改良分子信标-双重实时荧光PCR检测SARS病毒的方法,用于SARS的早期诊断和动物溯源。方法利用改良分子信标技术、装甲RNA和双片段双色荧光技术,根据GenBank公布的SARS病毒聚合酶基因1b的阅读开放框架结构的保守序列,自行设计一对引物和探针,以部分临床标本的酶联吸附实验结果和传统细胞培养方法作为对照,建立分子信标检测SARS病毒的方法。对368份临床标本(咽漱液、血液、粪便、尿液)、52份细胞培养液和50份动物标本进行荧光PCR扩增。结果分子信标检测SARS病毒的方法灵敏度为10～100个拷贝ml,与流感病毒等呼吸道病毒无交叉反应。分子信标检测368份临床标本,20份阳性。其中确诊病例阳性率为21.27%(1047),确诊病例的咽漱液阳性率为43.48%,还分别从粪便和血清中检测到SARS病毒。52份细胞培养液,29份阳性,阳性率为55.77%。50份动物标本,23份阳性,阳性率为46%。结论改良分子信标-双重实时荧光PCR检测SARS病毒方法灵敏度高、特异性强,可用于SARS的临床早期诊断和动物溯源。

摘要：目的通过克隆肠道病毒71型结构前体蛋白P1和非结构蛋白3CD,构建共表达P1前体蛋白和非结构蛋白3CD的真核双基因表达载体。方法设计合成脑心肌炎病毒(EMCV)IRES序列的特异性引物,克隆至真核表达载体pcDNA3.0上,命名为pc-IRES。从手足口病重症患者分离EV71病毒株,经逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术分别扩增出EV71病毒的P1前体蛋白区与3CD区的片段,并将其定向克隆至真核表达载体pc-IRES载体中IRES序列的上游和下游,随后转化到大肠埃希菌DH5α中,最后经PCR和双酶切鉴定转化菌落。结果通过重组质粒p-IRES-P1-3CD进行酶切和DNA序列分析,重组真核双基因表达载体p-IRES-P1-3CD构建成功。结论成功构建共表达EV71病毒P1前体蛋白和非结构蛋白3CD真核双基因表达载体,这将为下一步制备基于DNA载体的EV71病毒的类病毒颗粒疫苗打下基础。