摘要：为了鉴定引起海南定安县番茄叶片呈蕨叶型或变窄成线条状,叶片表面凹凸不平、生长不规则等症状的病原物,对该病样的叶片提取总RNA,反转录成第一链c DNA,然后根据CMV RNA1保守序列设计2对特异引物,再利用常规PCR方法鉴定其病原是否为CMV。利用两对特异引物进行PCR方法扩增后,分别获得大小约为500 bp和700 bp的目的 DNA条带,经序列相似性比对,发现海南定安县番茄的病原物为CMV。构建系统进化树和同源性分析,进一步确定了引起番茄叶片蕨叶和生长不规则的CMV为重花叶株系(包括蕨叶症状),属CMV IB亚组。本研究鉴定了CMV是引起番茄叶片蕨叶和生长不规则等症状的重要病原物,通过序列比较和同源分析确定了该病原物为CMV的重花叶株系(包括蕨叶症状)。

摘要：2015年12月,为了分析采自海南海口城西仙人掌mat K基因的序列及同源关系,利用RNA plant Reagent试剂盒提取仙人掌叶总RNA,反转录成第一链c DNA。同时设计仙人掌成熟酶K基因(mat K)的1对保守引物,利用RT-PCR的方法扩增仙人掌成熟酶K基因,所得序列经Blastn进行比对,发现与已报道的22个仙人掌mat K基因核苷酸序列一致;利用Blastn的Distance tree of results构建系统进化树,结果显示海南仙人掌mat K基因与其它报道的30个仙人掌mat K基因同源性最高,同源性在99%以上,属于同一组,而与Opuntia basilaris(Gen Bank accession ***786750.1)同源性最低,为96.6%。本研究利用RT-PCR方法获得了仙人掌成熟酶K基因序列,同时构建的系统进化树确定了该仙人掌成熟酶K基因的同源关系。本结果将为海南仙人掌的进化研究提供科学线索。

摘要：产黑普雷沃氏菌(Prevotella melaninogenica)属革兰阴性专性厌氧菌,是引起牙周疾病的病原之一。为了研究牙周炎患者产黑普雷沃氏菌是否存在及其分子特征,用棉签刮取患者口腔,沸水-液氮法破碎细胞,同时设计产黑普雷沃氏菌糖基转移酶基因的1对引物,利用常规PCR方法扩增产黑普雷沃氏菌糖基转移酶基因。经NCBI序列相似性比对,发现该患者感染的产黑普雷沃氏菌糖基转移酶基因核苷酸序列与*** ATCC 25845菌株的糖基转移酶基因(Gen Bank accession ***002122)同源性最高,达92%;其编码的糖基转移酶部分氨基酸序列与***菌株的甘露糖糖基转移酶(Gen Bank accession ***_013264679)同源性最高,达98%。以糖基转移酶部分氨基酸序列构建系统进化树,结果表明,本试验获得的产黑普雷沃氏菌与其它报道的***菌株同源性最高,属于同一组(group)。

摘要：根据GenBank上已有的植物cat基因序列,设计一对兼并引物。在海南岛采集香蕉、巴西橡胶、黄灯笼辣椒、菠萝、甘蔗、番木瓜等作物的叶片并提取总RNA,反转录成cDNA,PCR进行同源克隆。结果获得了巴西橡胶cat-1和香蕉的cat-2基因,而未获得其它4种作物cat相关基因。序列分析发现,巴西橡胶cat-1和香蕉的cat-2基因开放阅读框(ORF)都为1 479 bp,编码492个氨基酸,GenBank登陆号分别为HQ660587和HQ660588。生物信息学软件分析巴西橡胶CAT-1和香蕉CAT-2蛋白的三级结构分别与Exiguobacteriu Oxidotolerans(PDB code:2j2mA0)和Pseudomonas Syringae(PDB code:1m7sA)相似。构建系统发育树表明巴西橡胶CAT-1与蓖麻CAT-1氨基酸序列(Ricinus communis:XP_002521709.1)同源性最高,为92.1%;香蕉CAT-2与油棕CAT-2氨基酸序列(Elaeisguineensis:ACF06566.1)同源性最高,达90.9%。

摘要：通过对辣椒全基因组数据库分析获得黄灯笼辣椒eIF4E基因家族的四个基因,设计两端带有Eco RⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物分别扩增四个基因的ORF,克隆到LexA-酵母双杂交系统的激活域载体pB42AD中,并构建pB42AD-eIF4E、pB42AD-eIF(iso)4E、pB42AD-eIF4E-Xm、pB42AD-n CBP9090重组载体。将重组质粒导入酵母菌株EGY48(p8op-Lac Z)中,进行重组激活域载体的毒性检验和自激活验证。结果表明,扩增获得了正确的黄灯笼辣椒Cc-eIF4E、Cc-eIF(iso)4E、Cc-eIF4E-Xm、Cc-n CBP9090基因ORF,并成功克隆到pB42AD载体中,同时转化有激活域载体的EGY48(p8op-Lac Z)在SD/-Trp/-Ura营养缺陷型平板上生长良好,在SD/-His/-Ura平板上不生长,说明重组质粒表达产物对该酵母细胞无毒性,对下游报告基因无自激活作用。本研究结果证明pB42AD-eIF4E、pB42AD-eIF(iso)4E、pB42AD-eIF4E-Xm、pB42AD-n CBP9090重组载体可用于该系统的互作蛋白筛选,为下一步通过酵母双杂交系统筛选与黄灯笼辣椒eIF4E家族蛋白相互作用的病毒蛋白奠定基础。

摘要：根据实验室测得的槟榔植原体膜蛋白基因(Ac Pmp)序列设计1对特异引物mp-FP/mp-RP,以病样槟榔总DNA为模板扩增该Ac Pmp的编码区并连接到p MD19T simple中间载体。将测序正确的阳性菌提取质粒p MD19T-Ac Pmp,经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后回收Ac Pmp片段,然后以正确的编码框连接到原核表达载体p ET32a(+),转化Escherichia coli BL21感受态细胞。含有p ET32a-Ac Pmp的BL21表达菌经IPTG诱导和SDS-PAGE分析表明,在30℃,0.1 mmol/L IPTG条件下诱导4 h,可产生部分可溶性的融合蛋白。利用Ni2+-NTA亲和层析柱法进行纯化并获得高纯度的可溶性融合蛋白。将纯化后的融合蛋白多次免疫家兔,取其抗血清,以融合蛋白(1∶10 000稀释)作抗原,间接ELISA法测定抗血清效价大于125 000。Western Blot杂交结果表明槟榔植原体膜蛋白抗血清能与融合蛋白特异性结合。

摘要：初步分析植原体免疫膜蛋白的结构,以Imp构建诱饵质粒,为研究植原体与寄主互作的分子机理,探讨植原体传播、侵染及在寄主内的运输方式奠定基础。根据本实验室获得的花生丛枝植原体免疫膜蛋白基因序列设计特异性引物Imp-F/Imp-R,通过PCR扩增获得花生丛枝植原体免疫膜蛋白基因,大小519 bp,编码蛋白含有172个氨基酸残基,与SPWB膜蛋白的核苷酸差异一个碱基,氨基酸序列相同。另外与WBDL膜蛋白的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为79.8%和70.2%。对其进行系统发育树分析;初步分析imp基因编码蛋白的跨膜区和疏水区。分析结果表明:花生丛枝植原体免疫膜蛋白C端有一跨膜锚定区,N端主要为膜内亲水区,没有前导信号序列。预测花生丛枝植原体免疫膜蛋白是一类C端跨膜的植原体免疫膜蛋白。将imp基因克隆到带有λcI基因的pBT质粒上,构建诱饵载体pBT-Imp,并通过IPTG诱导表达,western blot检测和自激活检验对其进行检测。结果显示:所构建的诱饵载体pBT-Imp可用于细菌双杂交的进一步实验。

摘要：[目的]鉴定引起海南水茄叶片呈典型皱缩和轻微花叶症状的病原物。[方法]对该病样提取总RNA,反转录成第一链c DNA,然后设计WTMV(Wild tomato mosaic virus)cp基因的特异引物,再利用常规PCR方法鉴定其病原是否为WTMV。[结果]通过PCR扩增获得一段约900 bp的DNA序列,包含WTMV全部CP(813 bp)蛋白基因编码区。分析表明该片段编码270个氨基酸,与WTMV-Laichua分离物核酸序列同源性为89%,氨基酸序列同源性为94%,且在所有的WTMV分离物中保守,可形成一个小的group。与其它马铃薯Y病毒属病毒的同源关系依次是PVMV、Chi VMV-Ⅰ、其它16个potyviruses(包括8个属于Chi VMV-Ⅱ的Chi VMV)。[结论]确定了引起海南水茄叶片皱缩和轻微花叶症状的病原物为野番茄花叶病毒(WTMV)。海南WTMV该分离物CP蛋白基因的Gen Bank登录号为KR781519。据我们所知,这是国内首次发现WTMV自然侵染水茄。

摘要：2014年在海南辣椒病毒病调查过程中发现了一种疑似病毒感染的辣椒样品,主要表现为叶片黄化、绿斑驳、叶脆易折断,且在田间发生较多。利用马铃薯Y病毒属的简并引物对其叶片总RNA进行RT-PCR检测,并将约1 700 bp目的片段克隆到p MD18-T载体上进行测序和BLAST分析。结果表明:该条带序列(包含部分NIb和部分cp基因)与已收录的甜椒脉斑驳病毒(Pepper veinal mottle virus,PVMV)(Gen Bank登录号:FM202327)序列相似性最高,达99%。设计cp基因的特异引物,对上述样品进行cp基因扩增并构建以cp基因序列为基础的系统进化树,发现海南辣椒上的PVMV与台湾的PVMV分离物ns1株同源性最高。田间检测结果表明:海南黄灯笼辣椒上PVMV的检出率高达74.07%,说明PVMV可能成为海南辣椒生产上的潜在威胁。

摘要：由甘蔗黄叶病毒所引起的甘蔗黄叶病是甘蔗生产中潜在的重要病毒病害之一。该病毒属黄症病毒科(Luteoviridae)中的马铃薯卷叶病毒属(Poleroviruses)。根据甘蔗黄叶病毒海南分离物(SCYLV-CHN-HN1)全基因组序列(Gen Bank ***342888),设计P0蛋白基因的一对特异性引物P0-Bait F/P0-Bait R。以实验室保存的重组质粒p MD18T-P0为DNA模板,PCR扩增P0蛋白基因。然后将P0蛋白基因和细菌双杂交诱饵质粒p BT分别进行双酶切后,连接构建重组诱饵质粒p BT-P0。经PCR扩增、双酶切鉴定和序列分析,表明获得了细菌双杂交重组诱饵载体p BT-P0,且编码框正确。将重组载体p BT-P0转化细菌双杂交系统Bacterio Match RⅡScreening Reporter感受态细胞,进行自激活和毒性验证。结果显示p BT-P0重组载体在细菌双杂交系统中无自激活作用及毒性作用,表明本试验构建的p BT-P0可应用于该系统筛选与之互作的寄主蛋白。