摘要：目的制备地高辛标记基因探针,利用分子杂交试验同时检测手足口病患者粪便标本中的肠道病毒(Pan-enterovirus,PE)、肠道病毒71型(Enterovirs 71EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsachie virus,CoxA16)。方法根据GenBank已发表的基因序列,分别在PE、EV71、CoxA16保守区设计3对特异性寡核苷酸引物,进行实时荧光定量PCR检测。从PE、EV71、CoxA16阳性标本中分离病毒,提取RNA,以RT-PCR扩增产物作为基因探针的目的基因,采用随机引物法进行Digxigenin-11-dUTP标记,采用分子杂交试验检测3种基因探针的灵敏性和特异性。结果 RTPCR分别扩增出116、226、208bp目的基因片段,经标记后作为检测PE、EV71、CoxA16的3种高纯度的基因探针,对相应病毒RNA的最低检出限均为1pg,可分别与PE(+)、EV71(+)、CoxA16(+)标本提取的RNA发生特异性杂交,与乙型脑炎病毒、诺如病毒、轮状病毒、H3N2、甲型H1N1流感病毒的核酸无杂交反应。结论制备的PE、EV71及CoxA16基因探针灵敏、特异,操作简单,适用于手足口病病原的实验室检测。

摘要：目的建立多重聚合酶链反应(multiplex polymerase chain reaction)方法,检测手足口病患者粪便、咽拭子标本中的肠道病毒(Pan-enterovirus,PE)、肠道病毒71型(Enterovirs71EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsachie virus,CoxA16)。方法设计3对寡核苷酸引物,分别在同一体系中扩增PE、EV71及CoxA16特异性基因片段,优化反应体系,测定该方法的灵敏性,并用乙型脑炎病毒、轮状病毒、单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型检测其特异性。结果对临床标本作多重PCR检测,EV71(+)标本可见264bp和440bp两条特异性条带,CoxA16(+)标本可见440p、550bp两条特异性条带,PE(+)EV71(-)CoxA16(-)标本可见440bp1条特异性条带。病毒cDNA最低检出浓度分别为4.78、2.36和43.27μg/ml。提取乙型脑炎病毒、轮状病毒、单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型核酸,进行同体系、同条件多重PCR扩增,均为阴性。结论多重PCR方法能在一个反应体系和反应条件下同时检测PE、EV71、CoxA16,且特异性强,灵敏度高,可用于手足口病的临床诊断和流行病学调查。

摘要：生物芯片是世纪之交迅速发展起来的一项分子生物学新技术 ,因具有与芯片相似的微型化和大规模分析、处理生物信息的特点而得名 ,它能在一块或若干块芯片上完成生物样品的分离、制备及生化反应的进行如核酸产物的分离、杂交以及ＰＣＲ等诸多生物学过程 ,显示出快速、高效率、高通量处理生物学信息的能力[1 ] 。1　生物芯片的概念生物芯片技术的发展最初得益于Ｓｏｕｔｈｅｒｎ提出的核酸杂交理论 ,即标记的核酸分子能与被固化的、与之互补配对的核酸分子杂交。 1 989年 ,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ提出了利用在玻片表面固定的寡核苷酸探针杂交进行基因序列测定的实验设计 ,随后 ,多个研究小组开展了类似的研究工作[1 ] 。 1 998年底 ,人类基因组计划 (ＨＧＰ)已完成了作图计划并进入大规模测序和基因识别阶段 ,这极大地带动了人类疾病相关基因和与人类疾病发生有密切关系的病原微生物基因的定位、克隆、结构与功能研究。随着信息、材料、机械、微电子等学科的广泛渗透和深入应用 ,基因工业已初显端倪 ,生物芯片就是在这种背景下发展起来的一项高新生物技术和一种高新技术产业[2 ] 。生物芯片是分子生物技术、机械制造技术、计算机技术等学科的交叉、结合 ,...

摘要：目的　研究汉坦病毒G2膜蛋白基因在甲醇营养型巴斯德毕赤酵母中的克隆表达。方法　采用RT PCR扩增G2基因 ,转化感受态大肠杆菌DH5α,DNA序列分析后 ,SnaBI、NotI两次酶切下G2 ,再连接到经同样酶切的pPIC9K表达载体上 ,构建表达载体 pPIC9K G2 ,SalI线形化后电转化导入毕赤酵母宿主菌GS115 ,G418筛选转化子 ,1%甲醇诱导、摇瓶培养。结果　序列分析表明 ,克隆序列与设计相符 ,12 %SDS PAGE显示重组蛋白为5 0KD ,Western Blot证实其生物学活性。