摘要：目的克隆独行菜强心苷生物合成途径关键酶甲羟戊酸激酶(mevalonate kinase,MK)基因,进行生物信息学分析,原核表达、纯化和组织特异性分析。方法通过分析独行菜转录组数据,设计基因特异性引物,克隆了LaMK基因的cDNA序列,构建p ET-32a-La MK原核表达载体,诱导表达LaMK重组蛋白。结果 LaMK基因的开放阅读框(opening reading frame,ORF)全长为1 137 bp,编码379个氨基酸。生物信息学分析显示,La MK蛋白可能定位于细胞质中,没有跨膜区不含信号肽,含有GHMP激酶家族保守结构域和ATP结合位点。系统进化分析显示,La MK蛋白与拟南芥等十字花科植物的MK蛋白同源性较高。在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达La MK重组蛋白,利用Ni2+亲和色谱得到了纯化的La MK重组蛋白。荧光定量PCR结果表明,LaMK基因在花中表达量最高,叶和根中次之,茎中较低,在幼苗中表达量最低。结论本实验为下一步制备La MK蛋白抗体,研究La MK基因在独行菜强心苷生物合成途径中的功能奠定了基础。

摘要：目的为了研究地黄萜类化合物生物合成途径的功能基因,从地黄中克隆了一条新的地黄GGPPS基因(RgGGPPS2),进行生物信息学分析,原核表达、纯化以及基因表达模式分析。方法根据地黄转录组数据中RgGGPPS2基因的序列信息,设计特异性引物,克隆了RgGGPPS2基因的开放阅读框(ORF)序列,构建pET32a-RgGGPPS2原核表达载体,用IPTG在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达RgGGPPS2重组蛋白,荧光定量PCR检测RgGGPPS2基因的组织特异性表达。结果 RgGGPPS2基因的ORF为867 bp,编码289个氨基酸。生物信息学分析结果发现RgGGPPS2蛋白含有2个富含天冬氨酸的基序FARM(first aspartate-rich motif)和SARM(second aspartate-rich motif),RgGGPPS2与芝麻、长春花等双子叶植物中GGPPS蛋白的同源性较高。通过构建pET-32a-RgGGPPS2原核表达载体在大肠杆菌中成功表达RgGGPPS2重组蛋白,利用Ni2+亲和色谱得到了纯化的RgGGPPS2重组蛋白。荧光定量PCR结果显示RgGGPPS2基因在根中表达量最高,其次是叶,茎中最低。结论克隆了RgGGPPS2基因,获得了纯化的RgGGPPS2重组蛋白,为研究RgGGPPS2基因在地黄萜类化合物生物合成途径中的功能奠定了基础。