摘要：为挖掘新的拟除虫菊酯类农药降解基因,在大肠杆菌中实现异源高效表达,以本课题组前期筛选出的降解谱广泛、降解率较高的菌株解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)为研究对象,克隆其菊酯类农药降解酶基因BioH,在大肠杆菌中表达。通过解鸟氨酸拉乌尔菌全序列进行基因组注释、蛋白注释和通路注释,和已有菊酯类农药降解基因序列比对,筛选出潜在的具有菊酯类农药降解功能的基因;以解鸟氨酸拉乌尔菌基因组DNA为模板,根据功能基因序列设计特异性引物进行PCR扩增,回收目的片段后与pMD19-T载体连接,筛选阳性克隆并鉴定;酶切回收目的片段后和pET32a(+)表达载体连接,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,将验证正确的重组菌经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析蛋白表达情况。结果表明:通过筛选得到BioH基因,该基因具有水解酶的作用,同时也具有其他菊酯类农药降解基因序列中存在的保守五肽motif-GXSXG,PCR扩增后得到大小为783 bp的条带,通过重组技术获得阳性克隆,PCR扩增、酶切和DNA测序进行验证,重组菌经0.2 mmol/L IPTG诱导4 h后获得约为43 ku(包括6×His标签)分子量大小的重组蛋白,该蛋白以包涵体形式存在。本试验筛选并克隆出BioH基因,成功构建原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中得以表达。