摘要：根据GenBank中20株猪圆环病毒(PCV2)核苷酸序列设计两对引物,建立的检测猪圆环病毒的多重PCR方法,其中引物P1、P2为PCV特异性,扩增938bp片段。P3、P4为PCV2特异性扩增490bp,因此本方法不仅可以扩增PCV片段,还可以同时区分PCV1和PCV2。该方法具有良好的特异性和敏感性,为猪圆环病毒的临床诊断与流行病学调查等研究奠定了基础。

摘要：利用Red重组系统和家蚕核型多角体病毒(BmNPV)Bacmid在*** DH10Bac中快速敲除BmNPV极晚期表达因子基因vlf-1,调查对病毒复制的影响,以探究BmNPV vlf-1基因的功能。首先从*** BW25113中提取能表达Red重组酶的质粒pKD46,将其转化到*** DH10Bac中,获得可用于BmNPV基因打靶的DH10Bac(含有质粒pKD46)菌株;再为发生基因同源重组设计一对长60 bp的引物,5'端长40 bp,分别为vlf-1基因的左右同源臂,3'端长20 bp,分别为氯霉素抗性基因(cat)的首尾序列;以含有cat的pKD3质粒为模板,PCR扩增含vlf-1同源臂的cat基因,即打靶线性化片段;将该线性化片段转入DH10Bac(pKD46)菌株,在Red重组酶的作用下,线性化片段与Bacmid DNA中的vlf-1基因发生同源重组。利用设计的2对特异性引物PCR验证cat基因替换vlf-1基因操作成功,获得vlf-1缺失型BmNPV。将vlf-1缺失型Bacmid DNA转染BmN细胞,利用qPCR分析vlf-1基因缺失对于病毒复制的影响,结果表明:vlf-1基因缺失对BmNPV起始DNA复制没有明显的影响,但是可能影响之后的病毒装配和侵染。

摘要：为建立一种快速准确检测猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)的基于TaqMan实时荧光定量PCR方法,根据猪繁殖与呼吸综合症病毒的ORF7保守序列分别设计引物和TaqMan探针,在常规PCR的基础上,设计并优化基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测PRRSV的方法。结果表明本研究建立的基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR体系相关系数大于99%,扩增效率为97%,具有良好的线性关系。利用建立的方法检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、日本脑炎病毒(JEV),结果均为阴性,说明此方法具有较好的特异性。灵敏度试验表明该方法检测极限为5copies/μL;应用建立的方法对58份血清样本和60份组织样本进行检测,共检测出14份阳性血清和10份阳性组织。这些结果表明本研究建立的基于TaqMan探针的PRRSV实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性、灵敏度、重复性,可为临床检测PRRSV提供更高效的技术平台。

摘要：为构建猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)2型(PCV2)感染性DNA克隆,以淋巴结病料组织中分离的PCV2细胞培养适应毒株为材料,通过基因序列分析比对,在PCV2基因组序列XbaⅠ酶切位点区设计重叠引物,进行全长扩增并克隆至pMD-18T和pBluescript SK,获得载体pMD-PCV2和pBluescript SK-PCV2。将pMDPCV2重组质粒大量扩增后,用XbaⅠ切出PCV2全基因组,在体外用T4DNA连接酶使其自环化。通过脂质体法将PCV2自环化产物转染至PK15细胞,并且经15次连续传代,分别用PCR、RT-PCR和间接免疫荧光测定(Indirect immunofluorescence assay,IFA)检测到PCV2的复制、转录和蛋白表达。该研究成功构建具有感染性的PCV2全基因组DNA,为PCV2致病机理和基因功能研究奠定基础。

摘要：设计合成两对覆盖PCV2基因组全长的引物,对PCV2分离株S2、P11、L进行全基因测序。将所测序列与GenBank上已公布的PCV2毒株序列进行同源性比较,并绘制系统发育进化树。结果显示,所测毒株与其它地域的24株PCV2分离株的基因组序列同源性很高。3个分离株之间的全基因核苷酸同源性在95.4%～99.3%。序列分析表明欧洲分离株和美洲分离株分别构成PCV2的两个大的分支:欧洲系和美洲系。S2、P11属于欧洲系,L属于美洲系。