摘要：为建立灵敏且可绝对定量检测猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的微滴式数字RT-PCR(ddRT-PCR)方法,以SIV M基因的保守序列为靶基因,设计并合成一套特异性引物和TaqMan探针,建立了可对主要流行的H1N1、H1N2和H3N2亚型SIV绝对定量检测的通用型ddRT-PCR方法。随后,对该方法的敏感性、特异性和重复性进行评价,并利用临床猪鼻咽拭子样品进行检测验证。结果显示:建立的ddRT-PCR方法检测限达到1.6 copies/µL,灵敏度极高;能特异性检出H1N1、H1N2和H3N2亚型SIV,与猪瘟病毒等其他常见猪病病原均无交叉反应;重复检测结果的批内和批间变异系数(CV)分别为0.75%、3.17%,重复性良好;经临床样品检测验证,建立的ddRT-PCR和荧光RT-qPCR方法分别检出阳性样品72、66份,提示前者在检测低病毒拷贝样品时较荧光RT-qPCR更优。结果表明,本研究建立的SIV通用型ddRT-PCR方法灵敏度高,特异性和重复性均良好,且在检测低病毒含量临床样本时更具优势,可作为一种对SIV感染进行早期诊断和绝对定量检测的有效方法。

摘要：为建立伪狂犬病病毒(PRV)野毒株与gE基因缺失疫苗株的鉴别诊断和准确定量的微滴数字PCR(ddPCR)方法,本研究以PRV gD和gE基因为靶基因,设计并合成了2套特异性引物和Taq Man探针,建立了分别针对PRV gD和gE基因的dd PCR方法。结果显示,本研究建立的dd PCR方法能够特异性地鉴别检测PRV野毒株和疫苗株,与圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等均无交叉反应;该方法针对PRV gD、gE基因的检测限分别为3.9拷贝/μL、2.3拷贝/μL,分别比相应的荧光定量PCR (qPCR)方法敏感性高10倍和5倍;针对PRV gD、gE基因的批内和批间重复性试验结果变异系数(C.V)均小于4%;通过对45份临床样品的检测,结果显示,与病毒分离方法相比,dd PCR方法敏感性为91.7%,特异性为97.2%,符合率为97.8%;与dd PCR方法相比,q PCR的敏感性为83.3%,特异性为94.3%,符合率为95.6%。本研究建立的dd PCR方法在检测低拷贝临床样品时敏感性更高、特异性强、重复性好,可以作为PRV野毒株与疫苗株的鉴别、准确定量的有效检测手段。

摘要：为实现对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)野毒株与gE基因缺失疫苗株的快速、敏感、特异的鉴别诊断,本试验针对PRVgD和gE基因设计了2套特异性引物和TaqMan探针,建立了PRV野毒株与gE基因缺失疫苗株的TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法,对引物和探针浓度、退火温度等进行了优化,对方法进行敏感性、特异性、重复性试验,并进行临床样品检测。结果显示,建立的针对gD、gE基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法线性相关系数(R2)分别为0.996和0.980,均呈良好的线性关系;检测限分别为39.4和12.1拷贝/μL;与圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应;重复性试验结果显示,针对gD基因的批内和批间变异系数分别为1.43%~1.86%、1.10%~2.07%,针对gE基因的批内和批间变异系数分别为0.98%~1.41%、1.12%~1.86%。应用建立的TaqMan实时荧光定量PCR与普通PCR分别对11份临床疑似感染样品进行检测,阳性率分别为36.4%和27.3%。结果表明,该方法敏感性高、特异性强、重复性好,可作为伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株的早期鉴别诊断和定量检测的有效手段。

摘要：以H1N1亚型猪流感病毒(SIV)3种主要谱系2009甲型H1N1(pdm/09 H1N1)、古典型H1N1(CS H1N1)和类禽型H1N1(a H1N1)的血凝素(Hemagglution,HA)基因为靶基因,设计3对特异性引物,建立一种可以同时检测一个反应体系中H1N1亚型3种主要谱系SIV的三重RT-PCR方法,并将其应用于临床样品的检测,旨在为开展猪群中流行的H1N1亚型SIV感染及流行情况的调查研究提供有力技术支撑。结果显示,该方法可对pdm/09 H1N1、CS H1N1和a H1N1这3个不同谱系SIV特异性检出,扩增片段大小分别为476 bp、293 bp和997 bp,而与其他病毒无交叉反应;最低检测限分别为1 460拷贝/μL、1 700拷贝/μL和1 950拷贝/μL;应用到3 110份临床样品检测中,检测出10株pdm/09 H1N1和21株a H1N1 SIV,未检测到CS H1N1 SIV,与鸡胚分离病毒符合率达100%。综上,该方法敏感性和特异性良好,能快速、有效实现对临床样品中H1N1亚型3种谱系的检测。

摘要：根据Gen Bank中甲型、古典型和类禽型三个谱系H1N1猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的血凝素(Haemagglutinin,HA)基因保守序列,分别设计了3对特异性引物,建立了H1N1亚型三个谱系SIV的RT-PCR快速鉴别诊断方法。该方法能够对甲型、古典型和类禽型三个谱系的H1N1亚型SIV做出准确诊断,扩增片段大小分别为476 bp、293 bp和997 bp。敏感性试验结果显示,该方法对三个谱系病毒的最低检测限分别为1 896拷贝/μL、1 655拷贝/μL和1 459拷贝/μL;特异性试验显示,该方法可特异性检出古典型、类禽型和甲型H1N1三个谱系的SIV,而与H5、H7和H9亚型流感病毒、猪瘟病毒及猪繁殖与呼吸不障碍综合征病毒均无交叉反应;重复性试验表明,3次重复检测结果具有良好的一致性。以上结果表明,该RT-PCR分型诊断方法的敏感性、特异性和重复性良好,为有针对性地对猪流感采取综合防控措施提供重要技术支撑,具有良好地应用前景。

摘要：为了建立快速检测H1N1亚型猪流感病毒的荧光RT-PCR方法,试验根据Gen Bank中H1N1亚型猪流感病毒HA基因和NA基因的序列,利用Premier express设计并合成两对特异性扩增引物和Taqman探针,采用荧光RT-PCR方法检测H1N1亚型猪流感病毒。结果表明:荧光RT-PCR方法可以特异、高效地检测临床样品。说明该方法能够用于临床及实验室猪流感病毒的快速诊断和检测,及时、有效、科学地指导辽宁省猪群疫病的防控。

摘要：根据GenBank中已发表的传染性喉气管炎病毒全基因组序列(NC006233)设计引物,以传染性喉气管炎病毒WG株基因组为模板,PCR扩增糖蛋白gJ基因,并对其进行序列分析。用DNAStar软件分析gJ蛋白的抗原性,选择抗原性强的140aa～483aa片段,克隆并连接到原核表达载体pET-32a(+)中,转化BL21(DE3)菌株。经IPTG诱导后,获得大小为65.2ku的重组蛋白,命名为r-gJ,表达量占菌体蛋白总量的60.8%;Western blot分析表明r-gJ具有较强的抗原性。

摘要：本研究根据猪瘟病毒(CSFV)基因组的NS5B基因片段,设计了4条针对NS5B基因6个位点的RT-LAMP扩增引物,建立的方法能特异性地检测出CSFV,而PRV、PPV、PRRSV、PCV、FMDV等病毒扩增结果均为阴性;该方法与猪瘟荧光RT-PCR方法相比,特异性无明显差异,敏感性高10倍;另外,该方法耗时短,只需1h,操作简单,不需要PCR仪等特殊仪器,扩增产物可通过肉眼观察、或加入荧光染料在紫外灯下观察特异性荧光、也可通过凝胶电泳检测,因此适合从临床病料中快速准确检测出猪瘟病毒感染情况,适合推广应用于基层和野外现场。

摘要：根据GenBank中的传染性喉气管炎病毒(ILTV)全序列(NCBI登录号:NC-006623),利用Oligo6.2分析序列并设计6对引物,以ILTVWG株基因组DNA为模板,PCR扩增了长度为13.1kb的区域,得到了完整的WG株的Us区序列,初步鉴定了WG株的Us区基因结构。将WG株的Us区序列分别与ILTVUSDA株、BHV-1、CeHV-1、EHV-1、HSV-1、HSV-2、MDV、PrV、HVT、VZV相比较,ILTVWG株与USDA株同源性为99.2%,而与其他疱疹病毒之间的同源性较低,而且Us区大小也不一致;与已发表的ILTVUSDA株Us区基因序列分别比较后发现,两者之间差异较大的基因分别为gJ基因和gD基因。其中,gJ基因在第1983个碱基处比USDA株多出30bp,DNAStar预测这30bp可能形成一个独立的抗原表位;gD基因的长度在不同的ILTV毒株之间差别较大,与其他疱疹病毒具有相似的结构特征。