摘要：目的克隆和表达肝片吸虫组织蛋白酶L基因(FhCL),分析其免疫原性。方法根据GenBank公布的FhCL基因序列设计引物,以肝片吸虫总RNA为模板,通过RT-PCR扩增FhCL基因编码序列,PCR产物经TA克隆,通过EcoRⅠ、HindⅢ双酶切和测序鉴定获得重组质粒pMD18-T/FhCL,并将其亚克隆入原核表达载体pET30a(+),经PCR,以及BamHⅠ、HindⅢ双酶切和测序鉴定,构建原核表达质粒pET30a(+)-FhCL,转化大肠埃希菌(***)BL21(DE3)pLysS,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并获得纯化的重组蛋白FhCL,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,以及蛋白质印迹(Western blotting)分析该重组蛋白对感染肝片吸虫的山羊血清及免疫的SD大鼠血清的免疫反应性。结果PCR和BamHⅠ、HindⅢ双酶切均可见约1000bp的条带,测序结果显示重组质粒pET30a(+)-FhCL构建成功。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白相对分子质量约为Mr42000(含6个组氨酸标签),与目的蛋白相符,以包涵体形式表达。Westernblotting分析结果显示,纯化的重组蛋白FhCL可被感染肝片吸虫的山羊血清和免疫的SD大鼠血清识别,在目的条带Mr42000处见单一特异性条带,而阴性对照血清则无反应带。结论克隆及表达了肝片吸虫组织蛋白酶L编码基因,重组蛋白具有良好的免疫原性。

摘要：构建轮状病毒SA11株NSP2蛋白原核表达质粒,纯化重组蛋白并制备多克隆抗体。根据GenBank中登录的轮状病毒SA11株NSP2基因组序列(LC178571.1)设计特异性引物,用PCR方法扩增并将其连接至pET-28a(+)载体,构建重组表达质粒pET-28a-NSP2,转化至*** BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,并通过SDS-PAGE和Western blot鉴定。将纯化后的重组蛋白与ISA206佐剂乳化免疫豚鼠,制备NSP2多克隆抗体,并通过ELISA测定抗体效价。重组蛋白以包涵体的形式表达,相对分子质量为35 kDa,ELISA法测定多克隆抗体效价>1∶5000。成功表达了轮状病毒SA11株NSP2蛋白并获得其多克隆抗体,为NSP2蛋白结构与功能的研究奠定基础。

摘要：目的克隆和表达肝片吸虫谷胱甘肽S-转移酶基因(FhGST)以研究重组蛋白免疫学特性。方法参考Gen-Bank上发表的FhGST基因序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR法扩增FhGST基因,将扩增产物克隆入pET-30a(+),构建重组表达载体。经PCR、双酶切和序列测定鉴定后转入***21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting对该重组蛋白进行分析和鉴定。结果成功获得肝片吸虫GST基因全长为657bp的编码序列,SDS-PAGE结果表明重组蛋白分子量为31.3kDa,以包涵体形式表达。Western blotting结果证实重组蛋白能被其免疫的SD大鼠血清识别,表明其具有免疫原性;并且能与感染肝片吸虫的绒山羊血清发生反应,表明重组蛋白具有免疫反应性。结论成功的克隆了肝片吸虫谷胱甘肽S-转移酶基因,实现了在原核表达系统中高效表达重组蛋白,并具有良好的免疫学活性。

摘要：轮状病毒VP8＊蛋白由纤突蛋白VP4裂解形成,VP8＊蛋白决定了VP4蛋白血清特异性中和反应相关,本试验原核表达UK株牛轮状病毒VP8＊多拷贝嵌合肽段,纯化并比较分析其免疫原性。首先根据GenBank上发表的牛轮状病毒UK株VP8＊蛋白的编码序列及可能的主要抗原表位区（aa 1~11和aa 218~235）,设计并合成引物,以扩增这两个区段的嵌合基因,克隆到原核表达载体pET-28α（＋）上,并通过酶切位点连接构建嵌合基因的3拷贝重复重组表达载体,同时构建单拷贝和全长VP8＊表达载体。重组载体转化到***感受态细胞中,IPTG诱导表达后,重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot证实重组蛋白大小与预期相符且能与His-tag单抗发生特异性反应;ELISA结果表明免疫后3拷贝蛋白较单拷贝蛋白血清抗体水平更高。本试验确定了原核表达的3拷贝嵌合VP8＊重组蛋白免疫后具有良好的抗原性,为今后抗轮状病毒疫苗的研制及抗轮状病毒药物的发展提供参考。

摘要：轮状病毒(RV)是导致全球婴幼儿严重腹泻的重要病原体。由于缺乏完全基于质粒的反向遗传学系统,阻碍了对RV复制和发病机制的深入研究。经过多年来对轮状病毒反向遗传系统的开发,2018年终于成功研发了完全基于11个RV质粒的反向遗传系统,该技术不需要辅助病毒和辅助质粒的参与,不需要复杂的筛选过程,且重组病毒的拯救效率高。这项技术的成功研发,将加速RV基础生物学的研究,可应用于RV新型疫苗的设计、筛选RV抗病毒制剂,促进其他病毒反向遗传系统的研发。本文就轮状病毒反向遗传学系统的研究进展及应用作以简要综述。

摘要：目的为了分析原核表达的ETECF41和K99菌毛亚单位的抗原性和作为基因工程亚单位疫苗的可能性。方法针对黏附素F41和K99的编码序列,设计两对特异性引物,扩增F41和K99菌毛蛋白的编码基因,经序列测定后,克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,转化***21(DE3),筛选到可以表达F41和K99菌毛亚单位的菌株。经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blot试验分析原核表达的F41和K99重组蛋白的抗原性。结果表达的F41和K99菌毛亚单位蛋白可以与抗F41和K99菌毛蛋白的单因子血清反应。结论原核表达的F41和K99重组蛋白具有良好的抗原性。

摘要：目的建立检测牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)的Taq Man荧光定量PCR方法。方法根据GenBank中公布的BPIV3序列,选取P基因上保守区域设计特异性引物及TaqMan-MGB探针。优化反应体系,建立实时荧光定量PCR方法,并对方法的特异性、重复性和敏感性进行验证。结果标准曲线在104~108copies/μl范围内具有良好的线性关系,R^2达到0.999,斜率为-3.203,扩增效率为105.2%。利用该方法对BPIV3a及BPIV3c进行检测,结果为阳性,对牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(infectioils bovine rhinotraeheitis virus,IBRV)进行检测,结果呈阴性。3个浓度质粒标准品,重复3次检测,CV均小于1.5%。建立的方法对质粒的最小检出量为1.0×10~2 copies/μl。结论建立了能够检测BPIV3a及BPIV3c的TaqMan-MGB探针实时定量PCR方法,该方法特异性较强,重复性及敏感性良好,为早期诊断及定量分析提供了更快速、稳定、可靠的方法。

摘要：本研究扩增肝片吸虫(Fasciola hepatica,Fh)谷胱甘肽硫转移酶(GST)基因,并进行同源性分析。根据GenBank发表的部分Fh GST基因序列设计并合成一对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增出Fh GST基因完整的开放阅读框(openreading frame,ORF),测定序列,使用分子生物学软件进行同源性分析。获得Fh GST基因全长682bp,编码218个氨基酸,与澳大利亚分离的肝片吸虫GST同源性较高,与大片吸虫和卫氏并殖吸虫的GST也有较高的同源性。不同虫株GST基因具有较高的同源性,因此Fh GST蛋白不适合用作诊断抗原,但由于其存在交叉反应,GST基因作为分子疫苗的候选基因具有重要意义。肝片吸虫GST基因的克隆,为进一步研究GST蛋白的功能和作用奠定了基础。

摘要：概述了10 kV线路无功补偿的必要性;分析了10 kV电网无功管理误区;通过对变电站集中补偿、中压线路补偿、随机补偿、低压线路补偿、随器补偿等5种无功补偿方式的优劣分析比较,给出了10 kV无功补偿的优化设计方案。

摘要：轮状病毒是引起多种幼龄动物及5周龄以下儿童腹泻的主要病原体。NSP1非结构蛋白是轮状病毒基因5的产物,为长约55ku的RNA结合蛋白。现已发现NSP1蛋白是一种毒力决定因子,可颉颃宿主先天性免疫应答。参照GenBank收录的牛轮状病毒UK株序列设计并合成1对特异性引物,本试验利用RT-PCR方法扩增牛轮状病毒UK株NSP1基因,克隆入pET-28a(+)表达载体,经双酶切和测序鉴定,并利用分子生物学软件进行同源性比对分析。本试验结果显示获得的NSP1基因全长编码区序列为1 473bp,编码491个氨基酸,与美国WC3株同源性最高。将阳性重组质粒转入*** Rosetta(DE3)宿主菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白进行分析,结果表明重组蛋白分子质量约为55ku,以包涵体形式表达,可与鼠抗His-tag抗体反应。本试验成功获得牛轮状病毒UK株NSP1基因,且实现了在原核表达系统中高效表达重组蛋白,本试验结果为研究NSP1蛋白在细胞内定位与其活性之间的相互关系奠定了基础。