摘要：为提高枯草芽孢杆菌工程菌产角蛋白酶的能力并降低发酵成本,对发酵培养基进行优化。首先利用单因素试验对培养基成分和培养条件进行了优化,然后设计Plackett-Burman试验筛选得到酵母浸膏、pH、温度3个显著因素,最后设计Box-Behnken中心组合试验并进行响应面分析。确定了优化后的发酵培养基为30 g/L蔗糖、40 g/L豆粕、5.72 g/L酵母浸膏、3 g/L Na 2HPO 4·12H 2O、1.5 g/L KH 2PO 4、0.3 g/L MgSO 4·7H 2O;优化后的培养条件为温度37.69℃,接种量体积分数5%,pH 7.68。在此条件下,摇瓶发酵24 h角蛋白酶活性达到260480 U/mL,较优化前提高了4.26倍。在3 L发酵罐中连续发酵26 h角蛋白酶活性达到704400 U/mL。另外,优化后的发酵培养基原料成本降低了96%。综上,通过发酵优化有效提高了枯草芽孢杆菌产角蛋白酶的能力,极大地降低了发酵成本,为角蛋白酶的工业化生产奠定了基础。

摘要：角蛋白酶KerZ1在其最适反应温度60℃下能够有效地催化水解羽毛角蛋白废物,但热稳定性较差。以KerZ1为研究对象,利用蛋白的理性设计来提高其热稳定性。首先,通过分子动力学模拟软件AMBER16以及HotSpot Wizard服务器的B-factor分析预测出KerZ1中对热敏感的柔性环区域;然后,结合β-转角残基的统计分析将引入位置的原有残基替换为保守性较高的氨基酸。结果表明,突变体酶A128D的失活半衰期(t_(1/2))和半失活温度(T_(50))较KerZ1提高了12.32 min和5.8℃。同时,突变体的动力学参数(k_(cat)/K_(m))表征结果显示,其催化效率未受到显著影响。另外,分析突变位点以及周围氨基酸残基的分布,结果表明突变体酶A128D的表面亲水性增加可能是提高其热稳定性的主要原因。该研究通过理性设计柔性环区域提高了角蛋白酶的热稳定性,为推动角蛋白酶的工业化应用奠定了基础。