摘要：旨在克隆鸡β-防御素Gal-9基因,对其预测的成熟肽基因进行原核表达,并对产物进行抑菌活性的检测。根据GenBank发表的鸡β-防御素基因Gal-9(NM_001001611.2)设计引物,采用RT-PCR方法从鸡食道中扩增得到鸡β-防御素Gal-9基因,将该成熟肽基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)的EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切位点上,构建重组原核表达质粒pET-32a-Gal-9。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),于37℃进行诱导表达。结果扩增出Gal-9,其cDNA为204bp,成熟肽编码42个氨基酸。SDS-PAGE电泳表明,重组鸡Gal-9蛋白大小约为25ku,与预期大小一致,重组蛋白主要以包涵体形式存在。重组鸡Gal-9蛋白对金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、粪肠球菌(ATCC 29212)、大肠杆菌(ATCC 25922)、酵母菌(GS115)都能产生抑菌作用,最小抑菌浓度分别为62.50、31.75、125.00、31.75mg·L-1。成功获得了鸡β-防御素Gal-9成熟肽基因的表达产物,证实了重组鸡Gal-9蛋白具有广谱的抗菌活性,体外抑菌试验为其在家禽生产中应用提供了理论基础。

摘要：为检测比格犬α和β-干扰素(CaIFN-α和CaIFN-β),本研究根据GenBank中登录的IFN-α和IFN-β基因序列,分别设计合成特异性引物,以犬3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)mRNA为内参,建立SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。通过RT-PCR分别扩增IFN-α、IFN-β和GAPDH的基因片段,并克隆于pMD19-T载体中制备标准品,建立荧光定量RT-PCR标准曲线。结果表明:IFN-α和IFN-β和GAPDH基因的Ct值与标准品稀释度在1×102拷贝/μL^1×108拷贝/μL内均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.994。组内组间变异系数均小于3%,特异性和重复性较好。同时采用常规RT-PCR方法与本研究建立的方法对30份临床样品检测,结果显示IFN-α和IFN-β的阳性符合率分别为96.43%和96.55%。本研究建立的检测方法为比格犬IFN mRNA的定量分析提供了有效手段。

摘要：为获得比格犬β-防御素cBD1基因的表达产物,根据GenBank中登录的犬β-防御素基因cBD1(canis familiarisβ-defensin-like peptide 1)的序列设计引物,提取比格犬睾丸组织总RNA,利用PCR扩增cBD1基因,然后将其克隆至pET-32a(+)载体,构建原核表达质粒pET-32a-cBD1,通过PCR、酶切鉴定和测序确认,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中,并进行IPTG诱导和His-Ni-resin纯化目的蛋白。经SDS-PAGE检测,获得了约28ku的表达产物,与预期大小的β-防御素cBD1的分子质量相一致。Westernblot分析表明,表达产物与抗His标签鼠单克隆抗体发生反应,显示重组蛋白获得了表达。结果表明,成功表达的cBD1为新型抗菌制剂的研制奠定了试验基础。