摘要：目的构建小鼠短发夹RNA(shRNA)-Schlafen3(Slfn3)重组腺病毒载体,并检测其在内皮祖细胞(EPCs)中的转染效率。方法采用GenBank基因软件查询小鼠Slfn3基因序列,设计并合成3个siRNA片段及其引物,取腺病毒干扰载体pADV-U6-shRNA-CMV-EGFP,采用限制性内切酶进行酶切,线性化后连接siRNA片段,获得重组腺病毒载体shRNA-Slfn3,从中筛选阳性克隆抽提质粒,进行DNA测序验证;取对数生长期的人胚胎肾细胞HEK293,采用Admax系统将目的质粒转染至HEK293细胞,获得重组腺病毒shRNA-Slfn3后进行小量扩增及病毒滴度测定;取小鼠脾脏单个核细胞体外培养至对数期EPCs,用前述所得重组腺病毒shRNA-Slfn3对其进行转染48 h,采用绿色荧光蛋白量检测重组腺病毒的转染效率。结果测序验证3组目的质粒构建成功;获得shRNA-Slfn3重组腺病毒,病毒滴度分别为2.37×10^(13)pfu/L、3.16×10^(13)pfu/L及4.74×10^(13)pfu/L;EPCs转染效率为(63.64±2.58)%。结论成功构建了小鼠shRNA-Slfn3重组腺病毒载体,转染小鼠脾源EPCs后的转染效率较高。

摘要：目的：构建大鼠睡眠因子1（ Slfn1）基因的发夹状RNA质粒，并进行腺病毒载体包装。方法：根据Rat slfn1基因的转录本设计并合成3个干扰RNA靶点ShRNA-Slfn1（1）、ShRNA-Slfn1（2）及ShRNA-Slfn1（3），并将单链的引物退火成双链oligo序列，连接入双酶切线性化的RNA干扰载体（ pDKD-CMV-U6-shRNA）的U6启动子下游，替换掉原来的 ccdB 基因；利用 Admax 系统，将3种目的穿梭质粒分别与腺病毒骨架质粒共转染到HEK293细胞中重组获得病毒后进行小量扩增及病毒滴度测定；利用Slfn1过表达腺病毒质粒中目的基因携带Flag标签，通过Western Blot检测Slfn1过表达腺病毒质粒与靶点质粒共转染293T细胞中Flag表达，观察靶点质粒对Slfn1表达的影响。结果：经菌落PCR鉴定获得阳性克隆并测序验证正确，表明构建质粒成功；腺病毒包装ShRNA-Slfn1（1）、ShRNA-Slfn1（2）及ShRNA-Slfn1（3）的病毒滴度分别为1.0×1014 ifu/L，2.5×1014 ifu/L，6.3×1013 ifu/L，Western Blot证实ShRNA-Slfn1（1）及ShRNA-Slfn1（3）能显著降低转染293T细胞中Flag的表达，确定shRNA-Slfn1（1）及shRNA-Slfn1（3）为目的质粒。结论：成功构建了大鼠shRNA-slfn1的重组腺病毒载体。

摘要：目的构建大鼠shRNA-TRPC4重组腺病毒载体并观察其在大鼠内皮祖细胞(EPCs)中的转染效率。方法针对大鼠TRPC4序列设计4个RNA干扰靶点序列并合成双链DNA oligo,连接入干扰载体后转入大肠杆菌感受态细胞,培养后挑取转化子进行PCR鉴定及测序比对。利用Admax包装系统获得重组腺病毒Ad-shRNA-TRPC4小量扩增并测定病毒滴度,检测重组腺病毒对TRPC4表达的影响,最后将获得的重组腺病毒转染EPCs,在荧光显微镜下观察并用流式细胞仪测定其转染效率。结果 4组干扰质粒经培养后的转化子中均有阳性克隆,且阳性克隆与设计的干扰靶点序列一致;4组目的质粒均可抑制TRPC4蛋白的表达,合成的Ad-shRNA-TRPC4病毒滴度为5×1010 ifu/mL;倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测重组腺病毒在大鼠EPCs的转染效率分别为(85.47±2.05)%和(67.27±2.94)%。结论本实验成功构建Ad-shRNA-TRPC4载体,其在EPCs的转染效率高。