摘要：为能快速经济地获取小干扰核糖核酸(smallinterferingRNAsiRNA),设计采用特异性延伸引物和上游、下游两条通用引物,通过重叠延伸一步聚合酶链反应(PCR)法一次性快速、简捷地制备包含U6+1、H1或tRNAVal在内的三种人小RNA多聚酶III启动子-小发夹状RNA(shRNA)表达框.用该方法制备的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)特异性三种启动子-shRNA表达框在转染HepG2细胞后有效地抑制了EGFP转基因表达,其中以tRNAVal-shRNA表达框抑制效果最显著,且未检测到干扰素应答基因2'5'OASmRNA的表达,表明该表达框可被有效转染并启动产生特异基因的RNA干扰效应,进而用于快速筛选最佳siRNA位点及其最适搭配启动子.

摘要：目的以增强绿色荧光蛋白(EGFP)作为报告分子,探讨10-23 DNAzyme对乙型肝炎病毒(HBV)X基因表达的抑制作用。方法设计并合成3种能针对HBV X基因的特异性10-23 DNAzymes,分别命名为DrzHBVX-7、DrzHBVX-8和DrzHBVX-9,能分别特异地识别HBV X基因开放阅读框(ORF)的A1376UG。将内有HBV X全基因片段(不含终止密码)的融合表达质粒pHBx-EGFP与10-23 DNAzyme共转染AD293细胞作为共转染组,用pHBx-EGFP单独转染AD293细胞作为对照组,分别用荧光显微镜观察并用流式细胞仪检测细胞荧光强度,同时用半定量一步法RT-PCR分析融合荧光蛋白HBx-EGFP mRNA的相对表达量。结果各共转染组细胞荧光蛋白HBx-EGFP的表达均明显弱于对照组(P0．05)。结论10-23 DNAzyme对HBV X基因的表达有特异抑制作用,在HBV感染的基因治疗中会有潜在的应用价值。

摘要：目的:探讨10-23 DNA enzym e对乙型肝炎病毒C基因体外转录产物的特异切割活性。方法:设计并合成3种能针对乙型肝炎病毒C基因开放阅读框A1816UG的特异性脱氧核酶,分别命名为D rzBC-7、D rzBC-8和D rzBC-9。应用体外转录的方法获得相应的底物RNA,观察D rzBC-7、D rzBC-8和D rzBC-9对其的体外切割效应。以D rzBC-9为例,观察不同浓度的M gC l2对体外切割效率的影响,根据L inew eaver Burk作图法,计算相关的酶动力学参数Km、K cat和K cat/Km。结果:通过体外转录获得用于切割反应的底物RNA,其大小为300 nt。在特定的切割条件下,D rzBC-7、D rzBC-8和D rzBC-9均能对相应的底物RNA进行有效的切割,切割产物分别为109 nt和191 n。t以D rzBC-9为例,在切割反应体系中缺乏M gC l2时,未见有切割反应。M gC l2浓度在150 mm ***-1时达到最高切割效率,再提高M gC l2的浓度,切割效率未见明显增大。酶动力学参数Km、K cat和K cat/Km分别为1.4×10-9m ***-1,1.6 m in-1和1.1×109m ***-1.m in-1。结论:针对乙型肝炎病毒C基因的10-23 DNA enzym e在体外对相应的转录产物有特异切割作用。

摘要：乙型肝炎病毒(HBV)转录体上存在与相应的细胞核蛋白结合的特殊序列,参与转录体稳定性和核浆转运等转录后调节过程。更为重要的是,细胞因子介导非细胞损伤抗HBV的主要作用环节也是在转录后水平。因此,对HBV转录后调节机制的研究不仅能加深对HBV生活周期的认识,而且还将为抗HBV治疗提供新的设计思路。

摘要：核酶(ribozyme)是一类具有催化活性的RNA分子,可通过碱基配对特异地与相应的RNA底物结合,并在特定的位点切割底物RNA分子.自美国科学家Cech和Altman等发现核酶至今的20多年来,人们利用核酶可以特异性地切割靶RNA序列的特点,通过设计合适的核酶阻断特定基因的表达,已相继对获得性免疫缺陷综合征、肿瘤、生殖系统疾病、病毒性肝炎、白血病、移植排斥反应等进行了广泛深入的研究.尽管核酶已经开始应用于人体内治疗,但尚有许多问题有待解决[1].例如:如何获得高效、无毒的特异性核酶,如何选择靶序列中最佳切割位点,如何提高核酶进入靶细胞的效率并稳定发挥作用等.现仅就目前核酶在抗病毒基因治疗上的设计策略简要综述.

摘要：目的探讨不同结合臂长1023DNAzymes在2.2.15细胞内对乙型肝炎病毒S基因和C基因表达的抑制作用。方法设计并合成不同结合臂长的1023DNAzymes,能分别针对乙型肝炎病毒S基因和C基因开放阅读框A157UG和A1816UG。不同的1023DNAzymes分别转染2.2.15细胞,放射免疫分析法测定2.2.15细胞培养上清中HBsAg和HBeAg水平,实时荧光定量PCR法测定2.2.15细胞培养上清中HBVDNA水平。MTT法检测细胞毒性。结果不同结合臂长的1023DNAzymes在0.1～2.5μmol/L浓度范围内均能有效抑制HBsAg和HBeAg的表达,抑制效应可长达72h。在同一剂量相同转染时间的条件下,不同结合臂长的1023DNAzymes对HBsAg和HBeAg表达的抑制率呈以下关系:DrzBS9>DrzBS8>DrzBS7;DrzBC9>DrzBC8>DrzBC7。DrzBS9和DrzBC9在2.5μmol/L剂量条件下,转染48h后对HBsAg和HBeAg表达的抑制率可分别高达95%和92%。不同结合臂长的1023DNAzymes对2.2.15细胞培养上清中HBVDNA水平并无明显影响。MTT细胞毒性检测表明,在0.1～2.5μmol/L浓度范围内未见1023DNAzymes对2.2.15细胞的毒性作用。结论不同结合臂长1023DNAzymes在2.2.15细胞内对乙型肝炎病毒S基因和C基因表达均有一定的抑制作用,DrzBS9和DrzBC9的抑制作用较强。

摘要：目的　研究核酶抗丙型肝炎病毒(HCV) 的有效切割位点并获得高效、特异、无毒、价廉的HCV 特异性反式核酶。方法　根据文献报道的序列设计、合成HCV5′非结构(NC) 区和核心(C)区的特异性反式核酶基因并分别克隆进入真核细胞表达载体pSV2***SRα中,转染HCV 感染的MT2 细胞,用定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR) 、核酸杂交等方法测定核酶对HCV 的抑制作用。结果　所用的HCV5′NC 区核酶和C 区核酶对HCV 均有显著的抑制作用,抑制率分别为54 .7 % 和62 .1 % 。两者联合作用时抑制率达78 .8% 。结论　HCV5′NC 区和C 区特异性反式核酶在HCV 感染的体外细胞培养模型中对HCV 复制有明显的抑制作用;