摘要：目的研究靶向敲除CDK2对人黑素瘤移植瘤中miRNA表达谱的影响。方法设计CDK2的sgRNA靶向序列,构建含有sgCDK2-108的重组CRISP/Cas9慢病毒质粒并转染至HEK293T细胞进行重组慢病毒的包装和纯化。在SPF级的BALB/c-nude小鼠右前肢腋下皮下注射1×10^7个人黑素瘤细胞A375进行体外移植瘤小鼠模型构建。移植瘤成瘤第35天时,瘤内注射1×10^7 TU的重组sgCDK2-108和sgCDK2-NC慢病毒并继续培养30 d后收集样本。miRNA高通量测序检测靶向敲除CDK2后移植瘤内miRNA表达谱的改变、进行miRNA靶基因、GO富集分析、KEGG通路分析、新型miRNA鉴定及二级结构预测。结果sgCDK2-108慢病毒感染组与sgCDK2-NC阴性慢病毒感染组相比,共鉴定出762个miRNA,其中上调表达35个miRNA、下调表达13个miRNA;与移植瘤组相比,共鉴定出754个miRNA,其中上调表达28个miRNA、下调表达4个miRNA。miR-1a-3p、miR-133a-3p、miR-133b-3p和miR-375-3p为共同差异表达miRNA且具有多个潜在靶分子。GO分析显示miRNA靶基因功能主要为细胞代谢调控等,KEGG通路分析显示主要涉及RNA降解和自噬等。共鉴定出290个新型miRNA且具有“V”型或“直线”型两种结构。结论靶向敲除CDK2能够改变人黑素瘤移植瘤内的miRNA表达谱。

摘要：目的探讨慢病毒介导的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)2-shRNA对人黑色素瘤细胞A375凋亡的影响。方法依据CDK2基因序列,设计3条靶向干扰CDK2的序列,构建CDK2-shRNA慢病毒载体,质粒转染人胚肾细胞株(HEK293)细胞进行慢病毒包装,滴度测定包装的重组p GMLV-CDK2-shRNA慢病毒,免疫印迹检测对CDK2的干扰效率及对细胞周期蛋白(cyclin)E、E2F1、RB蛋白表达的影响,四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)检测细胞增殖活力,Annexin V-FITC/PI染色流式细胞仪检测A375凋亡的发生。结果成功获得包装的重组p GMLV-CDK2-shRNA慢病毒,病毒滴度为5×108TU/ml。重组的p GMLV-CDK2-shRNA慢病毒能有效下调CDK2、cyclin E、E2F1蛋白表达,抑制A375细胞增殖和触发凋亡。结论基于慢病毒介导的CDK2-shRNA能够促进黑色素瘤细胞A375凋亡发生,为黑色素瘤的基因治疗提供理论支撑。