摘要：N-糖基化是真核生物蛋白质最重要的翻译后修饰之一。以Armillariella tabescensβ-甘露聚糖酶Man47为研究对象,利用计算化学对***β-甘露聚糖酶Man47进行理性设计,经过分子对接、二级结构分析和糖基化的可行性分析后,构建具有EAS(enhanced aromatic sequence)序列的突变体g-123作为N-糖基化的突变位点。将其整合到毕赤酵母表达载体SMD1168上,通过电转化得到重组转化子。最后对突变体g-123的温度稳定性、酸碱稳定性、胃蛋白酶和胰蛋白酶抗性进行分析。结果表明:糖基化***β-甘露聚糖酶Man47突变体g-123与野生型相比,其热稳定性、酸碱稳定性、蛋白酶抗性均得到不同程度的改善。

摘要：饲料用酶在饲喂过程中,不可避免地会受到消化道中蛋白酶的破坏而令其使用效率受到影响,因此,饲料酶的蛋白酶抗性是其十分重要的性质之一。基于酶反应原理与计算化学理论对Bacillus subtilis 168β-1,4-内切木聚糖酶(Xyn A)的胰蛋白酶抗性进行理性设计,最终得到三个突变体——Xyn A^(R121C)、Xyn A^(R121C/K98Q)和Xyn A^(K39I)。酶学性质分析显示Xyn A^(R121C)和Xyn A^(R121C/K98Q)与野生型(Xyn A)的最适反应温度均为60℃,Xyn A^(K39I)为40℃;突变体酶与野生型酶的最适p H都是6.0;人工肠液(p H 6.8,10 mg/ml胰蛋白酶溶液)处理野生型及其突变体后,Xyn A^(R121C/K98Q)和Xyn A^(R121C)的残留酶活力均明显比野生型高,它们的半衰期分别是野生型的2.02倍和1.52倍,Xyn A^(K39I)在胰蛋白酶溶液中的半衰期为90min,比野生型缩短了37 min。

摘要：利用定点突变的方法提高Armillariella tabescensβ-甘露聚糖酶MAN47的胰蛋白酶抗性。首先根据其氨基酸序列,找到胰蛋白酶的水解位点—赖氨酸(Lys,K)和精氨酸(Arg,R),再利用生物信息学软件获得酶分子结构中K和R与周围溶剂的接触程度,选定暴露程度最大的K280为候选突变位点,进行模拟突变,并分析突变前后的氢键键长和整体结构的变化。根据氢键键长的变化,确定突变体为K280N。对K280N设计突变引物,用重叠延伸PCR技术对MAN47野生型man基因进行突变,PCR产物与大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达载体PYCα连接,在大肠杆菌DH5α中扩增后转入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae,经人工肠液(pH 6.8 10mg/ml胰蛋白酶溶液)筛选,得到抗胰蛋白酶的最佳突变株。结果表明突变酶在用人工肠液处理180min后,其半衰期为173min,而野生型酶为99min,其他酶学性质与野生型酶基本一致。

摘要：假密环菌是一种果树腐病菌,具有较强的分解代谢纤维素的能力。根据已克隆出的阿拉伯糖苷酶基因序列(Accession Number AJ620046)设计引物从假密环菌的mRNA中克隆出阿拉伯糖苷酶的ORF片段,构建重组质粒pPIC9-AF,与组氨酸标签融合,电转化毕赤酵母菌GS115并进行诱导表达。所得到的重组阿拉伯糖苷酶在30-35℃时有较高的酶活,最适反应活性pH值在 6．0～8．0之间,而在pH4．0～8．0范围内酶活基本保持在80％以上,比大多已报道的阿拉伯糖苷酶最适pH范围宽。对于高效表达重组阿拉伯糖苷酶以及对其进一步的酶学性质研究提供了良好的基础。