摘要：目的　建立缺口 连接酶链反应 (gapligasechainreaction ,G LCR)诊断新生儿沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)感染。方法　根据沙眼衣原体主要外膜蛋白基因设计两对探针 ,应用LCR技术扩增衣原体标准株DNA ,并用于检测 32 8例新生儿肺炎鼻咽拭子标本中的沙眼衣原体 ,在敏感性、特异性方面与传统的细胞培养法进行比较。结果　G LCR可检测出两个衣原体原体 ;可扩增 5种沙眼衣原体标准株DNA ,不扩增鹦鹉热衣原体及其他细菌DNA ,显示出很高的特异性。 32 8例鼻咽拭子标本中 ,G LCR扩增检出 6 7例阳性 ,培养检出 6 0例。经结果不一致分析后 ,共检出 6 9例阳性 ,阳性率为2 1%。以扩大标准为金标准判断 ,G LCR的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为 98 6 %、10 0 %、10 0 %和 99 6 % ,而培养则分别为 86 9%、10 0 %、10 0 %和 96 6 %。结论　G LCR检测新生儿沙眼衣原体感染具有较高的敏感性和特异性。G LCR是一种有应用前景的核酸扩增方法。

摘要：目的:建立高度灵敏特异的质粒缺口-连接酶链反应-酶联免疫吸附法(Gap-LCR-ELISA)检测沙眼衣原体(Chlamy-diatrachomatisCT)。方法:根据CT共有隐蔽性质粒设计并标记4条寡核苷酸探针,对6型CT标准株和鹦鹉热衣原体及其他常见泌尿生殖道病原菌行Gap-LCR-ELISA。结果:质粒Gap-LCR-ELISA可检测出6型CT,并与其他病原体无交叉反应,其最低检测限为2.5个原体(elementarybodiesEB)比PCR敏感10倍。结论:质粒Gap-LCR-ELISA对检测CT感染具有极高的灵敏度和特异度,适宜于我国进行大规模CT流行病学调查。

摘要：目的　建立检测沙眼衣原体感染的具有高度敏感性和特异性的缺口 连接酶链反应 酶联免疫吸附测定法。方法　根据CT主要外膜蛋白稳定区设计 2对互补探针并分别对其两端标记生物素和地高辛 ,对 6种CT标准株、鹦鹉热衣原体标准株和其他细菌进行Gap LCR反应并以ELISA和EB染色电泳检测扩增产物以比较两者的检测限度。 结果　Gap LCR可检出 6种CT标准株并不与其他细菌发生交叉反应 ,ELISA可检出 1 0fgDNA模板的扩增产物 ,较EB电泳法敏感 1 0倍。结论　Gap LCR ELISA是一高度敏感特异的检测CT感染的核酸扩增技术 。

摘要：目的 建立连接酶链反应-酶联免疫吸附试验(LCR-ELISA)检测沙眼衣原体DNA的方法,并初步应用于检测新生儿沙眼衣原体感染。方法 针对沙眼衣原体外膜蛋白基因设计4条引物,并分别在其两端标记地高辛和生物素。用此4条引物进行LCR扩增沙眼衣原体DNA。带有生物素和地高辛双标记的扩增产物以ELISA方法显色判断结果。采集328份肺炎新生儿鼻咽标本,分别对其进行培养和LCR扩增,应用ELISA检测有无沙眼衣原体感染。结果 LCR-ELISA方法可以检测出6种沙眼衣原体标准株,而对2种肺炎衣原体和其他细菌DNA无反应,显示出较强的特异性;可检测出10fg的DNA,较传统电泳法敏感10倍,且避免了溴化乙啶的污染。328份标本中,LCR-ELISA检测出68份阳性,培养仅检测出60份,两者相比差异有显著性。以扩大的金标准判断,LCR-ELISA的特异性、敏感性分别为100％和98.6％;而培养的特异性、敏感性分别为100％和、86.9％。结论LCR-ELISA是一种特异而敏感的基因扩增方法,避免了溴化乙啶污染,判断结果客观,检测方便。经临床初步应用,取得良好结果,值得进一步研究和完善。

摘要：目的探讨体外经5-氮杂胞苷诱导后的骨髓间充质干细胞(MSCs)分化成心肌样细胞过程中肌联蛋白在心肌结构蛋白发育过程中的作用。方法构建针对Wistar大鼠TITINN2B区设计的重组质粒pSITITIN,将其分别转染入体外培养7d的新生大鼠心肌细胞和经5-aza诱导后2周的MSCs中,免疫荧光检测肌联蛋白、MHC、肌动蛋白、cTnT的表达。结果重组质粒pSITITIN转染入正常心肌细胞后,肌联蛋白的表达减弱(P<0.001);转染入经5-aza处理的MSCs后,肌联蛋白、cTnT的表达减弱,MHC、肌动蛋白的表达无明显变化。结论MSCs可以被5-aza诱导分化成心肌样细胞,但分化程度不高,尚不具备完整的收缩结构基础,肌联蛋白对心肌结构蛋白发育过程有重要的意义。

摘要：背景：近年来通过细胞移植修复扩张型心肌病受损心肌、提高心功能已成为研究热点，但细胞移植后对心脏电生理的影响仍有待观察。目的：观察同种异体体内移植骨髓间充质干细胞移植后对扩张型心肌病模型兔心功能、结构及电生理的影响。设计，时间及地点：随机对照动物实验。于2004-01／2006—05在重庆医科大学附属儿科研究所电生理实验室完成。材料：选用43只新西兰白兔，体质量3．0～3．5kg，雌雄不拘。阿霉素为浙江海正医药公司产品，生产批号为050307。SSD-5000超声诊断仪为日本Aloka生产，RM6240多导电生理记录仪为成都仪器厂生产。方法：①摸球法将实验兔随机分为正常组（n=12），细胞移植组（n=13），模型组（n=13），后两组实验兔参考Amoda等的方法采用阿霉素诱导扩张型心肌病模型，每次1mg／kg，每周2次，连续8周，正常组不造模。获取剩余5只实验兔骨髓原液，用贴壁筛选法分离、扩增、纯化骨髓间充质干细胞。②细胞移植组及模型组模型建立成功后3周暴露心脏，将细胞分4点注射到左室前壁，模型组于相同条件下注射等体积DMEM／F12培养基。正常对照组在相同条件下不注射任何药品。主要观察指标：移植后4周，①采用超声诊断仪检测3组大鼠左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、左室射血分数、左室短轴缩短率等心功能指标。②应用多导电生理记录仪检测大鼠心肌单相动作电位振幅、0相上升的最大速率、单相动作电位时程从激动开始至复极完成50％及90％的时间，记为MAPD50及MAPD90。③取细胞移植组移植区心肌及模型组心肌标本，行透射电镜及光镜下组织学观察，同时进行植入细胞肌钙蛋白T和缝隙连接蛋白43的免疫荧光检测。结果：纳入实验兔43只，细胞移植组中各有9只因阿霉素急、慢性毒性作用以及手术后感染原因死亡，其余25只均进入结果分析。①心功能检测结果：细胞移植组实验兔左室收缩末期内径较模型组减小，左室射血分数、左室短轴缩短率均高于模型组，差异有统计学意义（P〈0．05）。②心电生理检测结果：细胞移植组实验兔MAPD50、MAPD90短于模型组，差异有统计学意义（P〈0．05）。③心肌组织学观察：模型组可见心肌细胞呈广泛的水肿和显著的空泡变性改变，电镜示心肌细胞线粒体肿胀，增生，肌节长短不一，出现异常收缩带，可见局部心肌溶解，细胞移植组移植区组织与之相比，各种受损表现较轻，且移植细胞有肌钙蛋白T和缝隙连接蛋白43的表达。结论：同种异体体内移植骨髓间充质干细胞后在一定程度上可改善扩张型心肌病模型兔心功能，减轻病理损害，并可能抑制心电紊乱的进一步发展。

摘要：目的构建携带磁共振报告基因magA的慢病毒载体质粒,初步检测其体外转铁效应。方法采用人工DNA合成技术合成目的基因magA,DNA重组技术将magA基因连接入慢病毒表达载体质粒pLenti-EGFP,酶切及DNA测序鉴定重组质粒pLenti-EGFP/magA的准确性。包装、包膜及重组质粒共转染293FT细胞包装慢病毒,收集包被magA基因的慢病毒上清并感染293T靶细胞,细胞培养基内加入500μmol/L枸橼酸铁连续4次传代,荧光显微镜观察并提取细胞行台盼蓝排除实验和普鲁士蓝染色,同时设立对照组行同样方法实验。结果酶切和DNA测序分析证实magA基因准确克隆入慢病毒表达载体设计位点,合成目的基因序列与GenBank中magA序列完全一致。荧光显微镜下观察包装细胞293FT细胞质内有大量绿色荧光表达,病毒滴度达到108 Tu/μl。慢病毒感染293T靶细胞后,细胞内稳定表达EGFP,且效率>80%。实验组及对照组台盼蓝拒染率分别为(92.80±2.65)、(93.50±1.29),2组拒染率差异无统计学意义(P>0.05)。普鲁士蓝染色发现实验组细胞内有大量蓝染铁颗粒形成,对照组呈阴性。结论 成功构建了携带磁共振报告基因magA的慢病毒表达载体,证实了magA基因在哺乳动物293T靶细胞内的转铁作用。

摘要：目的构建高效沉默小鼠Islet-1基因的慢病毒载体。方法针对小鼠Islet-1基因设计3个RNAi靶序列,合成相应的短发卡RNA(shRNA)寡核苷酸序列(oligo):Sh1、Sh2、Sh3,分别插入经酶切后的PLVTHM载体。经PCR和测序方法筛选阳性克隆,抽提阳性克隆质粒经大肠埃希菌扩增后,与其辅助包装质粒共同感染293T细胞制备慢病毒载体,利用斑形成试验测定病毒滴度。感染C3H10T1/2细胞株,以流式细胞仪检测其感染效率、荧光定量PCR检测其干扰效率。结果与正常C3H10T1/2细胞比较,测序及PCR结果显示目的片段插入正确;病毒滴度值为3.87×108TU/ml;慢病毒载体对C3H10T1/2细胞感染效率达90.36%;3个靶点(抑制效率分别为76.8%5、5.1%和11.7%)均有干扰效果,与正常细胞比较,Sh1靶点干扰效果最为显著(76.8%,P<0.05)。结论成功构建高效沉默Islet-1基因慢病毒载体。

摘要：目的 :建立缺口连接酶链反应方法检测沙眼衣原体。方法 :根据编码CT主要外膜蛋白的基因 (ompl)的稳定区设计2对互补的寡核苷酸探针。采用G -LCR和常规PCR扩增CT标准株DNA ,并对二者检测CT的敏感性进行比较。结果 :对5种CT标准株进行G -LCR扩增 ,均出现 5 4bp长度的DNA片段。敏感性实验可检测出 2个CT原体 ,而PCR可检测出2 0EBs。G -LCR较PCR敏感 10倍 ;在特异性方面 ,不扩增肺炎衣愿体及其他细菌DNA ,具有很高的特异性。结论 :G -LCR用于检测沙眼衣原体特异、敏感、快速、准确 ,可为CT感染的临床诊断提供依据。