摘要：为构建刚地弓形虫微线体蛋白3(MIC3)原核表达体系,获得高纯度MIC3蛋白用于制备单克隆抗体,评价MIC3蛋白在临床诊断方面的应用价值,根据刚地弓形虫MIC3基因编码的已知序列设计引物,应用PCR技术从刚地弓形虫NT株的基因组DNA中扩增出去除信号肽的MIC3基因,将该基因克隆入pET-32a(+)表达载体,构建pET-32a(+)表达载体,并转化入大肠杆菌(***)Trans 5α感受态细胞。扩增的MIC3基因与GenBank中相应基因序列(AF509564.1)的同源性达99.9%。将阳性重组表达质粒转化入*** BL21-codon plus,经IPTG20℃低温诱导表达,SDS-PAGE分析结果显示,MIC3融合蛋白分子量约为56 000。Western-blotting分析鉴定结果表明,MIC3融合蛋白可被猪抗弓形虫免疫血清所识别。获得的MIC3融合蛋白具有一定的反应原性,为下一步利用重组蛋白建立弓形虫的诊断方法和研制弓形虫的亚单位疫苗奠定了基础。

摘要：目的本研究以猪鼻支原体表面的可变脂蛋白(vlp)家族为研究对象,鉴定其各成员对宿主细胞的黏附能力。方法根据已公布的猪鼻支原体vlp家族7种成员的基因序列设计引物,构建重组表达质粒pET-32a(+)/vlp,筛选获得阳性克隆。重组工程菌经IPTG诱导表达目的蛋白,经镍柱亲和层析获得7种纯化的vlp重组蛋白。利用间接免疫荧光法及微孔板定量法分别对vlp各个成员的黏附功能进行鉴定。结果成功构建了7种重组表达质粒pET-32a(+)/vlp,获得阳性重组工程菌。经IPTG诱导及镍柱亲和层析纯化,获得了较纯的7种vlp重组蛋白。间接免疫荧光及微孔板黏附定量试验检测结果显示,重组蛋白vlpA、vlpB、vlpC、vlpE、vlpG可黏附PK细胞,而重组vlpD和vlpF蛋白黏附能力不明显。结论本研究成功构建了猪鼻支原体7种vlp的重组蛋白,并对其黏附功能进行了初步鉴定,证明部分vlp属于猪鼻支原体的黏附因子。

摘要：猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)可引起猪的多发性浆膜炎、关节炎、肺炎及中耳炎等多种慢性炎症,感染率极高,且与人类肿瘤的发生有关,对人类健康构成威胁。已有研究表明猪鼻支原体表面可变脂蛋白(vlp)家族参与支原体黏附宿主细胞的过程,本试验主要详细研究vlp家族成员之一vlpA的黏附细胞功能,特别是其Ⅲ区重复片段重复次数变化对其黏附能力的影响。根据GenBank中已公布的vlpA的基因序列,设计引物,从菌体DNA中扩增获得vlpA基因,或者人工合成Ⅲ区重复片段重复次数不等的一系列vlpA基因,均克隆至pET-32a(+)质粒中进行表达,获得目的蛋白质。同时利用固相合成法制备含两段Ⅲ区重复片段的多肽。利用间接免疫荧光试验和微孔板黏附试验检测所制备的各种重组vlpA蛋白和多肽的黏附功能。通过诱导表达和镍柱亲和层析纯化,成功获得纯度较高的各个目的蛋白质。利用间接免疫荧光试验证实vlpA可以黏附宿主细胞;利用微孔板黏附试验定量检测不含Ⅲ区的重组vlpA0蛋白及Ⅲ区重复片段多肽的黏附能力,结果发现vlpA0可黏附细胞,而Ⅲ区重复片段多肽无明显黏附能力;进一步利用微孔板黏附试验检测含Ⅲ区重复片段次数分别为3、6、9、12次的重组蛋白vlpA3、vlpA6、vlpA9、vlpA12的黏附能力,结果显示四种重组蛋白质均可黏附细胞,但黏附水平均低于不含Ⅲ区的重组vlpA0蛋白,且随着Ⅲ区重复片段重复次数的增加黏附能力下降。本研究结果提示vlpA为猪鼻支原体黏附因子之一,其Ⅱ区含有黏附位点,而整体分子的黏附能力随着Ⅲ区重复片段重复次数的增加明显减弱。本研究结果有助于进一步研究猪鼻支原体的黏附及致病机制。

摘要：为建立猪肺炎支原体(Mhp)显色原位杂交(CISH)定位检测方法,本研究利用地高辛标记的Mhp P36核酸探针和DAB/H2O2显色系统,对人工Mhp感染组、自然感染组和健康对照组的实验猪肺组织样品和临床样品进行显色原位杂交检测。结果显示,设计的地高辛标记探针针对Mhp具有特异性,而与其他的猪病原菌无交叉反应;检测结果可以通过显微镜观测到Mhp定位在支气管/细支气管黏膜表面。人工感染组、自然感染组和健康对照组的CISH结果与PCR检测结果一致,临床样品的CISH检测结果低于PCR检测结果。本研究建立的Mhp显色原位杂交法是一种集直观和敏感为一体的检测方法,可以用于Mhp的定位检测和致病机理研究。

摘要：探讨了不同组方中草药对鸡生长性能、脂肪代谢和胴体品质的影响。选用90羽14日龄的健康三黄鸡,随机分为3组,分别为对照组、试验组A和试验组B。每组30羽(15羽公鸡和15羽母鸡)。设计中草药配方Ⅰ和Ⅱ,分别以1%剂量在试验组A和试验组B的基础日粮中添加中草药配方Ⅰ和Ⅱ。实验期间,自由采食和饮水,按常规程序进行免疫。试验期21 d。结果表明:1)与对照组相比,饲料转化率分别提高1.98%和0.92%;日采食量分别降低6.73%(P<0.05)和4.87%(P<0.05);2)试验组A和试验组B中鸡的屠宰率分别比对照组提高5.01%和7.78%(P<0.05);半净膛率分别提高1.07%和8.22%(P<0.05);全净膛率分别提高3.92%和9.64%(P<0.05);试验组A中鸡的腹脂率比对照组鸡明显下降30.91%(P<0.05),而试验组B鸡的腹脂率没有发生显著性变化。以上试验结果表明,中草药配方Ⅰ对动物体脂含量具有重要的调节作用,而中草药配方Ⅱ对鸡的生长性能具有明显的促进作用。

摘要：注重习题情境化是理科教科书编排的重要特点之一。通过对2019年人教版高中理科教科书情境化习题的呈现方式、情境主题、情境类型三个维度的研究,发现如下特点:各学科情境化习题数量和占比差异较大,习题呈现方式多样、主题丰富,情境主题凸显学科特点,包裹型情境习题分布最广。为更好地发挥教科书的育人功能,建议增加情境化习题数量,发挥情境化习题优势;注重习题情境设计,提高习题品质;正确理解情境的“真实性”,关注情境的合理性;准确把握情境化习题要素,满足核心素养发展需要;注重习题情境多元化,实现多情境组合。

摘要：根据GenBank中猪肺炎支原体P36基因序列设计1对特异性引物,通过PCR扩增出猪肺炎支原体特异性蛋白基因P36,克隆入酵母表达载体pPICZα-A,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-P36。PICZα-A-P36经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。PCR鉴定为阳性的酵母转化子经甲醇诱导分泌P36蛋白于发酵上清液中,通过SDS-PAGE电泳以及Western-blotting进行鉴定,结果表明,P36蛋白基因获得了分泌性表达,而且具有良好的反应原性,这为猪肺炎支原体免疫检测试剂盒和基因工程疫苗的研制奠定了基础。

摘要：为建立快速检测猪鼻支原体(***)的荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank中登录的p37基因序列设计并合成引物及MGB探针,构建含有p37基因的重组质粒,以其为标准品绘制标准曲线,并检测该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示该方法具有良好的特异性,与猪肺炎支原体、猪絮状支原体、猪滑液支原体、鸡毒支原体、副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪圆环病毒、猪瘟病毒及猪流感病毒无交叉反应,对***的检测敏感性为10拷贝/μL,并且稳定性好,变异系数小于2%。利用建立的荧光定量PCR方法对55份临床样品进行检测,阳性检出率为87.3%(48/55),而分离培养方法和普通PCR的阳性检出率分别为41.8%(23/55)和29.1%(16/55)。该结果表明,建立的方法特异性强、敏感性高、稳定性好,可以用于***临床样品的检测,对***的快速和定量检测具有重要意义。

摘要：为了建立一种能够鉴别检测裂谷热病毒野毒株与NSs缺失型疫苗株的荧光定量RT-PCR方法,本研究通过对裂谷热病毒基因组序列进行比较分析,选择其S节段NSs基因及L节段L基因的无二级结构且保守的区段,分别设计多对引物和探针,通过试验验证并优化反应条件,筛选出最佳引物和探针的组合,建立了可以快速检测裂谷热病毒并区分NSs基因缺失疫苗株和野毒株的双重荧光定量RT-PCR方法。利用该方法检测羊临床常见病原,结果显示该方法仅对裂谷热质粒标准品样品检测为阳性,不与羊常见的其他病原出现阳性反应,特异性强;将裂谷热质粒标准品10倍倍比稀释后利用本研究建立的方法进行检测,结果显示,该方法对NSs和L基因重组质粒标准品的检测下限分别为10拷贝/μL和100拷贝/μL,敏感度高;重复性实验结果显示,该方法组内和组间变异系数均小于2%,重复性好。将NSs缺失型和非缺失型质粒分别转染细胞,提取核酸,利用本方法进行检测,结果显示该方法可有效区分NSs基因缺失型和非缺失型核酸样品。本研究建立的双重荧光定量RT-PCR方法为鉴别野生病毒株和NSs缺失型疫苗株奠定了技术基础。

摘要：为了研究Ⅱ类果糖二磷酸醛缩酶(FBA)是否为猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)的毒力因子,并参与其致病作用,根据已发表的猪肺炎支原体醛缩酶全基因序列设计特异性的引物,以猪肺炎支原体168株基因组为模板,通过Overlap PCR点突变扩增醛缩酶基因。将FBA克隆至pET-28a(+)载体后进行序列测定和分析,结果表明,FBA基因全长864 bp。将构建的重组表达质粒pET-28a(+)/FBA转化至大肠埃希菌BL21(DE3),通过筛选获得阳性克隆,重组工程菌在IPTG诱导下成功获得表达融合蛋白猪肺炎支原体Ⅱ类果糖二磷酸醛缩酶(Mhp FBA),大小约为35 ku。纯化蛋白并接种于猪气管上皮细胞至FBA终浓度分别为0、10、50、100、150、200μg/mL,孵育24 h后进行上清中丙酮酸浓度的检测和细胞凋亡检测。结果上清中丙酮酸浓度随着FBA浓度的上升,出现先极显著上升(P<0.01)、后急剧下降的现象;细胞平均凋亡率依次分别为3.54%、10.91%、13.99%、27.19%、32.84%和40.71%,并随着FBA浓度的升高而升高,且相比阴性对照组差异均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)。成功构建了Mhp FBA重组菌,表达获得了Mhp重组蛋白FBA,该蛋白可能为猪肺炎支原体的毒力因子,参与猪肺炎支原体的致病作用,从而为进一步开展Mhp致病机理和药物研究奠定基础。