摘要：目的探讨小檗碱对糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响及其机制。方法采用实验研究方法。配制含小檗碱终质量浓度分别为0(不含小檗碱)、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00、160.00μg/mL的小鼠真皮成纤维细胞(MDF)正常糖完全培养基(以下简称常规培养基)。取原代MDF,分别用常规培养基和MDF高糖(30 mmol/L葡萄糖)完全培养基(以下简称高糖培养基)培养,收集第3~6代细胞进行以下实验。取采用常规培养基培养的细胞,饥饿处理12 h后更换为含不同浓度小檗碱的常规培养基培养48 h,采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)筛选小檗碱最适作用浓度(样本数为6),用于后续细胞实验。取2种培养基培养的细胞,将采用常规培养基培养的细胞纳入正常对照组,将采用高糖培养基培养的细胞按照随机数字表法(分组方法下同)分为单纯高糖组和高糖+小檗碱组。分别用相应的培养基培养48 h后,采用CCK-8检测细胞活力,采用划痕试验和Transwell实验检测细胞24 h迁移能力,采用实时荧光定量反转录PCR法和蛋白质印迹法分别检测细胞中血小板源性生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β1(TGF-β1)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)和胱天蛋白酶3(caspase-3)的mRNA和蛋白表达水平,前述实验的样本数分别为6、3、9、3、6。取15只8周龄雄性BALB/c小鼠,构建糖尿病小鼠模型后在其背部制作全层皮肤缺损创面,分为单纯糖尿病组、糖尿病+低浓度(25μg/mL)小檗碱组和糖尿病+高浓度(75μg/mL)小檗碱组,分别作相应处理,每组5只鼠。伤后0(即刻)、3、7、14、21 d,采用ImageJ软件测量创面面积。伤后21 d,采用苏木精-伊红染色和Masson染色分别检测创面组织病理学变化及胶原生成情况,采用免疫组织化学法和实时荧光定量反转录PCR法分别检测创面组织中MMP-9、PDGF、TGF-β1、VEGF、CD31和caspase-3的蛋白和mRNA表达水平。动物实验的样本数均为5。对数据行单因素方差分析、独立样本t检验、Tukey检验、析因设计方差分析。结果培养48 h,筛选出小檗碱质量浓度为20.00μg/mL时细胞的活力最大。培养48 h后,与正常对照组相比,单纯高糖组、高糖+小檗碱组细胞活力均明显减弱(P<0.05);与单纯高糖组相比,高糖+小檗碱组细胞活力明显增强(P<0.05)。培养48 h后,划痕试验结果显示,与正常对照组相比,单纯高糖组、高糖+小檗碱组细胞24 h迁移率均明显下降(P<0.05);与单纯高糖组相比,高糖+小檗碱组细胞24 h迁移率明显升高(P<0.05)。培养48 h后,Transwell实验结果显示,与正常对照组细胞24 h迁移数(141±7)个相比,单纯高糖组、高糖+小檗碱组细胞24 h迁移数的(28±3)、(86±6)个均明显减少(t值分别为117.28、31.80,P<0.05);与单纯高糖组相比,高糖+小檗碱组细胞24 h迁移数明显增多(P<0.05)。培养48 h后,与正常对照组相比,单纯高糖组、高糖+小檗碱组细胞中PDGF、VEGF、TGF-β1、MMP-9 mRNA水平均明显降低(P<0.05),caspase-3 mRNA水平均明显升高(P<0.05);与单纯高糖组相比,高糖+小檗碱组细胞中PDGF、VEGF、TGF-β1、MMP-9 mRNA水平均明显升高(P<0.05),caspase-3 mRNA表达水平明显降低(P<0.05)。培养48 h后,与正常对照组相比,单纯高糖组、高糖+小檗碱组细胞中PDGF、VEGF、TGF-β1、MMP-9蛋白表达水平均明显降低(P<0.05),caspase-3蛋白表达水平均明显升高(P<0.05);与单纯高糖组相比,高糖+小檗碱组细胞中PDGF、VEGF、TGF-β1、MMP-9蛋白表达水平均明显升高(P<0.05),caspase-3蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。与单纯糖尿病组相比,糖尿病+低浓度小檗碱组小鼠伤后14、21 d及糖尿病+高浓度小檗碱组小鼠伤后3、7、14、21 d创面面积均明显减小(P<0.05);与糖尿病+低浓度小檗碱组相比,糖尿病+高浓度小檗碱组小鼠伤后3、7、14、21 d创面面积均明显减小(P<0.05)。伤后21 d,单纯糖尿病组小鼠创面组织尚未形成上皮,真皮层有大量炎症细胞和肉芽组织;糖尿病+低浓度小檗碱组小鼠创面组织大部分完成上皮化,真皮层有大量炎症细胞;糖尿病+高浓度小檗碱组小鼠创面大部分完成上皮化,真皮层有少量毛囊和炎症细胞。伤后21 d,与单纯糖尿病组相比,糖尿病+低浓度小檗碱组、糖尿病+高浓度小檗碱组小鼠创面胶原面积均明显增加(P<0.0