摘要：目的 :为了将雄性胎鼠组织细胞移植进入雌性受体鼠 ,Y染色体特异的性别决定区蛋白基因 (sexde terminingregionprotein ,Sry)作为常用的遗传标志需要在细胞分离前快速检测 ;为了检测孕 14d胎鼠的Sry基因 ,我们建立了一种快速的PCR方法。基于C5 7BL/ 6J小鼠Sry基因序列 ,我们设计了特异检测引物 ,并优化了PCR的反应条件包括引物和循环参数等。方法和结果 :模板的制备时间约 30min。取约 1mg胚胎组织 ,以 10mmol/LTris10mmol/LEDTApH 8 0缓冲液洗涤 2次 ,然后以 2 0 0 μL裂解液 ( 2 0mg/LproteinaseK ,0 5 %NP - 4 0 ,and 0 0 5 %Tween 4 0 )悬浮 ,再在 6 0℃孵育 15min以消化蛋白 ,95℃以上 5min灭活蛋白酶K。取 5 - 10 μL作为模板。PCR反应总体积为 5 0μL ,使用两套引物同时扩增 ,一套扩增Sry目的基因片段 ,另一套扩增IL - 3基因片段作为内对照。扩增时间为 1 5h。扩增产物 10 - 15 μL采用 2 5 % - 3%的琼脂糖凝胶在 12 - 15V/cm的电压下电泳。 10min即可观察电泳结果。根据引物设计判断结果 ,Sry目的基因片段为 4 4 4bp、IL - 3基因片段为 6 4 9bp。操作约 10个胚胎总时间小于 3 5h。PCR扩增的特异性与特异探针荧光原位杂交结果一致。结论 :该PCR方法为检测胎鼠性别决定区蛋白基因的快速、简单?

摘要：目的 :构建噬菌体表面表达随机 8肽文库 ;方法 :采用人工合成随机寡核苷酸、基因重组技术 ,噬菌体表面表达技术等 ,构建该文库 ;采用多聚酶链式反应技术、核酸杂交技术和测序分析评价鉴定。多聚酶链式反应所采用的上游引物包括载体克隆位点处部分碱基和部分外源基因的碱基 ;在核酸杂交中设计了噬菌体载体克隆位点互补探针 ,以更加准确地排除无外源基因插入的克隆 ;在测序鉴定中 ,选择了 2个混合探针杂交阳性的克隆。结果 :以上证实获得独特克隆为 2 1× 10 8;亲和富集实验证实所建噬菌体文库可以稳定扩展。结论 :我们成功地构建了噬菌体随机 8肽文库 ,其库容量为 2 1× 10 8。

摘要：目的构建含有人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(FABP4)基因启动子荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic-FABP4-promoter,为脂类代谢相关药物研究提供基础。方法根据已知人的FABP4基因启动子序列设计引物,以人DNA为模板,用PCR法扩增出人FABP4基因启动子的DNA大片段。经过限制性内切酶KpnI和XhoI双酶切后插入到pGL3-Basic载体中;测序鉴定;然后将这些重组质粒瞬时转染到K293细胞中,并在24 h后检测其荧光素酶活性。结果构建的含荧光素酶基因的质粒,经酶切及测序鉴定结果显示FABP4启动子插入的位置和序列正确。转染细胞后检测其荧光显示:重组pGL3质粒转录活性较pGL3-Basic质粒明显增强(P<0.001)。结论成功构建了pGL3-Basic-FABP4-promoter质粒,为进一步研究FABP4基因的表达调控提供了工具和基础。

摘要：目的筛选靶向抑制长链非编码RNA(lncRNA)浆细胞瘤转化迁移基因1(PVT1)的小干扰RNA(siRNA),并探讨其对人白血病细胞株K562细胞增殖的影响。方法针对PVT1设计合成PVT1-siRNA1、2、3、4序列及无关对照siRNA(SC-siRNA)序列。利用Hiper Fect转染试剂将各条siRNA转入K562细胞,实验依此分为siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组、siRNA4组和SC-siRNA组,并设空转组和细胞组。转染后用实时定量RTPCR检测细胞中PVT1 RNA的相对表达情况,用CCK8法检测细胞增殖情况,用流式细胞仪检测细胞周期。结果转染24、48 h后siRNA4组PVT1 RNA水平下降,与SC-siRNA组、空转组和细胞组相比差异有统计学意义(P0.05);转染24、48、72 h后siRNA4组细胞增殖抑制率都增加,与SC-siRNA组和空转组相比差异均有统计学意义(P<0.01);转染48、72 h后siRNA4组出现了G1期阻滞,G1期细胞比例增加,与SC-siRNA组、空转组和细胞组相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论 PVT1-siRNA可通过阻滞细胞周期的进展而抑制K562细胞的增殖。

摘要：为了探索肺炎衣原体感染和冠状动脉粥样硬化之间的关系、利用肺炎衣原体主要外膜蛋白基因上的保守序列设计的3条引物，通过多聚酶链反应检测32例冠状动脉左前降支粥样硬化斑块以及7例正常冠状动脉左前降支中肺炎衣原体。结果发现，32例有粥样硬化斑块的冠状动脉左前降支中有14例多聚酶链反应阳性．阳性率为43．75％，7例正常冠状动脉中无一例阳性，阳性率为0％。结果提示肺炎衣原体在有粥样硬化冠状动脉和正常冠状动豚中存在显著差异。

摘要：1 材料和方法1.1 内皮细胞培养 取新生儿脐带，收集内皮细胞。于37℃5%CO2培养箱内用含20%胎牛血清的M199培养基培养(含青霉素50 ku/L、链霉素100 mg/L、谷氨酸 2 mmol/L和GIBCO BRL)。采用形态及CD33免疫组织化学方法鉴定。1.2 Northern blot分析 取第2～4代内皮细胞，以5.0×104个/cm2接种于1%胎牛血清的M199培养基中培养48 h后，给予血管内皮细胞生长因子(VEGF)培养24 h，采用异硫氰酸胍酸酚一步法提取总RNA。紫外分光光度计测定RNA浓度。胶原基因IODN探针设计为5’-GGAGCTCCTGGGCCTCAGCC-3’；GAPDH探针设计为5’-TGAAGGTCGGAGTCAACGGA-3’。取15 μg RNA作变性甲醛电泳，转印于硝酸纤维膜，以鱼精DNA做预杂交，采用T4 DNA核苷酸激酶同位素标记反义ODN探针做杂交。经Northern blot印迹杂交放射自显影后，采用光密度扫描仪扫描，得该标本VEGF mRNA水平(以GAPDH为内对照)。实验重复3次，每次每组设6孔。