摘要：利用高保真PCR技术获得唐鱼(Tanichthys albonubes)长为1.3 kb的β-肌动蛋白(β-actin)近端启动调控序列(TA,1.3 kb)。在此基础上采用基因组步移技术(Genome walker)获得5′侧翼上游序列1.7 kb,再根据所获的近端启动子序列和上游序列设计引物,扩增获得全长为3.0 kb的唐鱼β-actin基因远端启动调控序列(TLA,3.0 kb)。此1.3 kb和3.0 kb启动调控序列均包含3个转录活性元件:CAAT Box(-89^-85),CArG Box(-59^-49),TATA Box(-26^-20)。利用启动子分析软件TRANSFAC 6.0分析,结果显示启动调控序列(-105~1261)中含有E-Box、NF-Y、Sp1等多个重要转录因子结合位点,在远端启动调控序列(-1719~1261)中还含有更多的重要转录因子结合位点。将这两个序列分别定向克隆到红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)表达载体中,构建重组表达载体pTLA-DsRed和pTA-DsRed,并分别注射到唐鱼受精卵中,结果显示转pTLA-DsRed基因唐鱼的阳性率较转pTA-DsRed的高,且所发出的红色荧光的强度也比后者的强。采用RT-PCR检测孵化后第15天的转基因唐鱼中RFP的mRNA,结果显示转pTLA-DsRed基因唐鱼中RFP mRNA的表达量比转pTA-DsRed基因唐鱼高35.7%。结果表明两种长度的启动调控序列均能有效驱使外源基因在唐鱼体内表达,且长度为3.0 kb的启动子序列具有更强的驱动活性。

摘要：目的　克隆和测定剑尾鱼 (Xiphophorushelleri)线粒体细胞色素b基因 (cytb)的全序列。方法　提取剑尾鱼肝脏的总DNA。设计合成特异引物进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖电泳检测、纯化后克隆到pGEM Teasyvectorsystem中的T载体上 ,筛选转化子 ,提取质粒 ,酶切鉴定。挑取重组质粒pGEM T xhcytb 11进行序列测定。结果　获得了剑尾鱼线粒体cytb基因的全序列 ,共 114 0bp。结论　用BLAST与GenBank中的线粒体DNA序列进行比较 ,显示剑尾鱼与其他鱼类的cytb基因具有较高的同源性 ;根据剑尾鱼与其他 13种鱼的cytb基因序列同源性所建立的进化树 。

摘要：采用RT PCR原理和长片段扩增技术克隆短沟对虾和斑节对虾酚氧化酶原基因。设计合成特异引物、提取血细胞总RNA ,反转录后扩增获得的特异片段回收并克隆到pGEM TEasyVector系统的T载体上 ,重组子进行碱基序列测定。结果表明 ,所克隆的短沟对虾酚氧化酶原基因含起始密码子ATG到终止密码子TGA的 2 0 5 5bp ,编码 6 84个氨基酸。斑节对虾酚氧化酶原基因含ATG到TGA的 2 0 6 1bp ,编码 6 86个氨基酸。短沟对虾酚氧化酶原推算分子量为 781 5 3Da ,等电点pI为 6 2 5 ;斑节对虾则为 785 81Da ,pI为 5 83。用DNA分析软件分析显示两种对虾酚氧化酶原基因具有高度的同源性 ,二者的碱基和推测的氨基酸序列同源性分别为 93 %和 92 %;对虾与其他节肢动物酚氧化酶原基因的同源性的高低与种类间亲缘关系相关 ;不同种类间酚氧化酶活性中心重要组成部分的 2个铜结合位点、位于铜结合位点内的6个组氨酸以及与铜结合位点相邻的氨基酸序列高度保守。

摘要：根据鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV)主要衣壳蛋白(Major Capsid protein, MCP)基因(mcp)序列设计引物,PCR扩增得到一长约1400bp的DNA片段, 将其克隆到pGEM-T Easy Vector。氨基酸亲水性分析表明,在150-250位氨基酸之间亲水性很高,可构成主要抗原决定簇及形成跨膜区。mcp基因经PCR改造后克隆至原核表达载体pBV220,构建表达MCP的大肠杆菌基因工程菌,该工程菌经42℃诱导,SDS-PAGE检测,在约50kDa处有一特异蛋白带,含量约为菌体总蛋白的23%。用纯化和复性后的蛋白免疫新西兰大白兔制备抗血清,Western-blotting分析显示,重组MCP制备的抗血清能与ISKNV MCP特异结合,说明表达产物具有与ISKNV MCP相似的抗原特性。

摘要：鳜(Siniperca chuatsi)传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)是鳜暴发性传染病的主要病原,给鳜养殖业造成了严重的经济损失,因此快速、灵敏的检测方法对鳜养殖业的发展具有非常重要的意义。根据鳜ISKNV主要衣壳蛋白(MCP)基因序列设计了2对引物,利用巢式PCR方法对病鱼脾肾组织进行扩增,建立了ISKNV快速特异的巢式PCR检测方法。应用该方法对含MCP基因的质粒进行倍比稀释后检测扩增的灵敏度可达到5fg;巢式PCR检测的灵敏度是一步法PCR的104倍以上。