摘要：【目的】建立一种新型的、能在基层场地进行实时便捷诊断的猪瘟病毒检测方法。【方法】环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)-横向流动试纸条技术(Lateral flow dipstick,LFD)相结合,针对猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)NS5B基因设计一套特异性引物及生物素标记探针,结合异硫氰酸荧光素标记的扩增产物,建立RT-LAMP-LFD检测方法。【结果】所建立的方法能够特异地检测出CSFV的存在,检测PRRSV、JEV、PCV-2等其他病毒均为阴性;所建立的CSFV-RT-LAMP方法对RNA的最低检测限为50 pg;反应快速,整个扩增反应可在1 h内完成;操作简单,不需要PCR仪等复杂的仪器,结果可经肉眼观察。【结论】应用RTLAMP-LFD检测CSFV特异性强、灵敏度高,并且操作安全、简便、快捷,可以满足基层检疫的需要。

摘要：【目的】构建混合谱系激酶结构域样(mixed lineage kinase domain-like,MLKL)基因敲除的PK-15细胞株(PK-15 MLKL-KO),研究敲除MLKL基因对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)复制的影响。【方法】根据MLKL序列设计特异性编辑位点,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MLKL-sgRNA编辑载体,转染至PK-15细胞,经嘌呤霉素药物筛选获得多克隆细胞系,通过有限稀释法获得PK-15 MLKL-KO单克隆细胞株。通过靶基因组PCR、测序和Western blotting验证MLKL基因在PK-15细胞上的敲除水平;采用Reed-Muench法检测病毒增殖水平;采用PI染色和荧光显微镜观察细胞坏死情况。【结果】试验成功构建MLKL-sgRNA载体,筛选出1株MLKL基因缺失647 bp的PK-15细胞株,Western blotting未检测到MLKL蛋白的表达。与PK-15细胞相比,PK-15 MLKL-KO细胞极显著或显著提高了PRV GD-WH(感染后36 h除外)和PRV Bartha-K61的病毒滴度(P<0.01;P<0.05)。PRV GD-WH和PRV Bartha-K61感染PK-15 MLKL-KO细胞后,坏死细胞明显减少。【结论】本研究构建了MLKL基因敲除的PK-15细胞株,与PK-15细胞相比,PK-15 MLKL-KO细胞显著提高了PRV GD-WH和PRV Bartha-K61的复制和存活能力,为PRV Bartha-K61疫苗生产过程中提高病毒产量提供了一种可行性策略。

摘要：荧光定量聚合酶链反应(qPCR)技术在非洲猪瘟病毒(ASFV)的检测中发挥重要作用,然而该方法也存在一些局限性。一方面由于检测环境中易产生气溶胶污染,经常导致qPCR检测产生假阳性结果。另一方面,临床上已发现MGF基因缺失的变异株,现有的检测方法将无法满足野毒株与变异株鉴别检测的需求。为了解决qPCR易产生假阳性,ASFV核酸检测靶标基因过分单一的问题,建立了ASFV的防污染双重qPCR检测方法。该检测方法根据C962R基因和MGF-505-2R基因的保守序列设计引物和探针,并在反应体系中加入UNG酶达到防污染的目的,建立了ASFV的防污染双重qPCR检测方法。结果表明,利用该方法对C962R基因和MGF-505-2R的基因标准品进行检测,该检测方法具有较好的鉴别诊断效果。该检测方法的标准曲线具有良好的线性关系,相关系数为0.99;敏感性高,最低检测限为10 copies/μL的ASFV基因标准品;特异性强,与猪丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、副猪嗜血杆菌(Hoemophilus parasuis)、猪链球菌(Streptococcus suis)、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)及猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)均无交叉反应;重复性较好,变异系数小于1.75%,使用该检测方法对194份临床组织样品检测,与商品化非洲猪瘟病毒抗原检测试剂盒比较,检测结果均为阴性,符合率为100%。该方法预期可用于ASFV野毒株与MGF-505-2R基因缺失株的鉴别诊断,为深入开展分子流行病学调查提供技术储备。

摘要：本研究根据猪伪狂犬病病毒gE基因保守区域设计特异性引物和LNA-TaqMan探针,建立了基于LNA-TaqMan探针的猪伪狂犬病病毒野毒株荧光定量PCR检测方法。结果显示:所建立的方法能够特异性的检测出猪伪狂犬病病毒野毒株;灵敏度更高,最低检测下限为10个拷贝/μL;批内变异系数和批间变异系数分别为0.43%~0.64%、0.44%~2.34%,重复性良好。对67份临床样品进行检测,病毒分离培养法检测出23份阳性样品,LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法检测出26份阳性样品,常规TaqMan探针法检测出21份阳性样品,与病毒分离法比较,LNA-TaqMan探针法的符合率为96%。本研究建立的基于LNA-TaqMan探针检测猪伪狂犬病病毒野毒株的荧光定量PCR方法,为猪伪狂犬病的诊断和流行病学调查提供了可靠的技术支持。

摘要：根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)P72基因核苷酸序列设计特异性引物和锁核酸(locked nucleic acid,LNA)-TaqMan探针,建立了基于P72基因的LNA-TaqMan探针的ASFV荧光定量PCR方法。结果显示,所建立的LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法具有较高的灵敏度,最低检测限为3.9拷贝/μL,且与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪圆环病毒2型等多种病原不存在交叉反应;该方法的重复性良好,批内和批间变异系数均小于1%;56份临床样品的检测结果与OIE推荐的qPCR方法检测结果一致,符合率为100%。结果表明,本试验所建立的ASFV LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法敏感性、特异性和重复性良好,为ASFV检测提供了一种新的技术选择。

摘要：D型流感病毒(IDV)是一种近年来新发现的正粘病毒科D型流感病毒属成员,可引起牛、猪、豚鼠等多种动物的呼吸道疾病,具有潜在的人兽共患性。基于HEF基因遗传多样性,IDV可分为5个不同的谱系,分别是D/OK、D/660、D/Yama2016、D/Yama2019和D/CA2019谱系。不同于甲型、乙型流感病毒,IDV的潜在N-糖基化位点主要集中分布在HEF基因上。为系统了解不同谱系毒株HEF蛋白的N-糖基化位点和B细胞表位,从Gen Bank数据库获得151条全长HEF基因序列,通过使用MEGA-X生物信息学软件构建遗传进化树,并用在线工具进行各毒株N-糖基化位点和线性B细胞表位预测分析。结果表明IDV的HEF蛋白具有6~8个潜在的N-糖基化位点,其中有2个N-糖基化位点(N146和N613)在不同谱系间相同,有6个N-糖基化位点(N28、N54、N249、N346、N390和N513)在不同谱系间存在差异。B细胞表位在不同谱系间有3个保守的表位和8~9个各谱系独特的表位。线性B细胞表位的预测将有助于设计激活体液反应的多表位疫苗,预测结果还需要体外和体内实验证实来证明该应用的可行性。

摘要：为了建立一种便捷、快速且精准的非洲猪瘟病毒的检测方法,本研究根据GenBank中公布的ASFV p72基因序列,设计了一对特异性引物,并对引物中的适当碱基进行锁核酸修饰,通过优化退火温度、引物浓度,建立了非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰引物PCR检测方法。结果表明,该方法具有良好的敏感性和特异性,检测灵敏度可以达到3×101copies/uL,比常规引物PCR方法的灵敏度提高了100倍,比real-time PCR方法的灵敏度提高了10倍,对猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒等病原基因组均无扩增,特异性良好。72份临床样品的检测结果与OIE推荐的qPCR方法检测结果一致,符合率为100%。本研究成功建立了非洲猪瘟病毒的LNA引物PCR检测方法,方法的特异性强、敏感性高,操作简单,为非洲猪瘟病毒的检测提供了一种新的、更加敏感的检测技术。

摘要：试验基于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)B646L(P72)蛋白基因序列,建立一种高灵敏度和高特异性的检测方法。采用Oligo 7软件设计一步法巢式锁核酸荧光定量PCR(One Step NestedLocked Nucleic Acid real-time PCR,LNA-OSN-PCR)的嵌套引物以及探针,并对外引物进行锁核酸修饰。建立并优化LNA-OSN-PCR反应体系和条件,确立LNA-OSN-PCR标准曲线,并检验LNA-OSN-PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。采用LNA-OSN-PCR方法,对96份临床疑似患病样品进行检测,同时与普通荧光探针PCR方法进行比较。试验确立并优化了LNA-OSN-PCR的反应条件和体系,建立的LNA-OSN-PCR标准曲线,具有较好的线性(R2=0.9945)。该方法的最低检测限为3×10^(-1)copies/μL,变异系数小于3%,并且与其他病毒或细菌核酸无交叉反应。LNA-OSN-PCR方法与OIE推荐的荧光定量PCR方法比较,检测灵敏度提高10~100倍,在对96份临床疑似患病核酸样品进行检测中,检出55份阳性,41份阴性,比常规的荧光定量PCR具有更高的阳性检出率。并且能获得典型的扩增曲线。试验结合一步法巢式PCR和锁核酸修饰,建立了ASFV一步法巢式锁核酸荧光定量PCR,为检测ASFV提供一种高灵敏度和高特异性且经济实惠的检测方法。