摘要：【目的】对粪肠球菌摇瓶发酵培养基进行优化,为高效、优质的微生态制剂产品研制奠定基础。【方法】首先通过二水平设计的Plackett-Burman试验分析发酵培养基中对粪肠球菌发酵影响最重要的主要因素;再运用最陡爬坡法对主要因素进行试验,获得主要因素的最适范围。最后通过响应面分析得到主要因素的最优水平。【结果】获得最优的发酵培养基配方为:蔗糖22.5%,酵母粉12%,蛋白胨10.5%,磷酸二氢钾0.2%,硫酸镁0.02%,硫酸锰0.004%,碳酸钙1%。【结论】在最优发酵培养基培养下,粪肠球菌的活菌数从初始的5.8×108CFU/mL提高到6.7×109CFU/mL。

摘要：贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis FX1是从新疆库尔勒香梨生产区果蔬天然酵素发酵液中分离筛选出的对梨火疫病菌Erwinia amylovora具有较强拮抗作用的菌株。为提高其抑菌活性物质的产量和防病效果,本研究以平板抑菌活性和发酵液活菌浓度作为检测指标,采用单因素试验、Plackett-Burman试验和响应曲面法对培养基成分(碳源、氮源、无机盐)及摇瓶发酵条件(温度、转速以及初始pH)进行筛选和优化,确定FX1菌株的最适培养基和发酵条件。结果表明,FX1的最适培养基为:玉米淀粉10.0 g/L,酵母膏25.1 g/L,KH2PO40.5 g/L,MnSO40.001 g/L;最适发酵条件为初始pH 7.0,转速150 r/min,温度30.9℃,装液量100 mL/500 mL,培养时间48 h。优化后FX1菌株活菌数可达1.53×109 CFU/mL,抑菌圈直径可达26.6 mm,相比优化前分别增加了3.10倍和1.32倍。苹果离体花序的防效试验结果显示,喷施FX1菌体发酵液、无菌发酵滤液和脂肽类物质粗提取液能显著降低花腐率(P<0.05),对梨火疫病的保护性防效分别可达68.53%、71.47%和76.30%,均高于优化前。研究结果为贝莱斯芽孢杆菌FX1菌剂的开发及其在梨火疫病生物防治中的应用提供了依据。

摘要：【目的】将叠氮溴化丙啶(PMA)与实时荧光定量PCR技术(qPCR)相结合,建立一种快速检测梨火疫病菌活菌的方法,为病害的检疫和早期诊断,开展病原学、流行规律研究及制定科学防控措施严防病害入侵提供技术支持。【方法】以梨火疫病菌(Erwinia amylovora)质粒pEA29设计特异性引物EaP29F1/EaP29R1,通过优化PMA的质量浓度和曝光时间,确定区分梨火疫病菌死活菌的PMA预处理最优反应条件,再以活菌DNA为模板进行qPCR的特异性扩增。设置不同比例死活菌混合体系,验证PMA-qPCR反应的可靠性。【结果】当梨火疫病菌浓度为1×10^8 CFU·mL^-1、PMA浓度为25μmol·L^-1、曝光时间为10 min时,能完全抑制死菌的扩增,仅以活菌体DNA为靶标进行选择性扩增。当活菌比例为10%~100%时(浓度为6.0×10^7~6.0×10^8 CFU·mL^-1),PMA-qPCR测得的活菌数与理论活菌数值均在同一个数量级,二者存在良好的线性关系(R^2=0.9928)。灵敏度检测结果表明,6.0×10^3~6.0×10^8 CFU·mL^-1范围内,梨火疫病菌活菌数与Ct值线性相关(R^2=0.9947),检测灵敏度下限为6×10^3 CFU·mL^-1(12 CFU/qPCR反应)。用建立的PMAqPCR方法检测人工接种发病的香梨、苹果、杜梨枝条,PMA-qPCR能准确检测其中的活菌,结果与菌落计数结果相符。【结论】本研究建立的PMA-qPCR检测方法能定量检测梨火疫病菌病活菌数量,具有灵敏、准确和高效的优点,避免了常规qPCR检测死菌导致的“假阳性”。

摘要：【目的】以棉花秸秆作为发酵基质,优化黑曲霉(Aspergillus niger) ZD固体发酵产纤维素酶的发酵条件。【方法】以固体发酵条件(棉花秸秆和玉米粉的比例、发酵时间、接种率、含水量和pH值)为优化因素,通过单因素试验和Plackett-Burman试验,确定主要影响因素;再由最陡爬坡试验确定优化中心点,最后通过Box-Behnken中心组合设计确定主要影响因素及其交互作用对固体发酵产酶的影响,并对其进行回归分析。【结果】由单因素试验和Plackett-Burman试验确定碳氮比,接种量和含水率为主要影响因素;最陡爬坡试验确定棉花秸秆与玉米粉的比例4∶1,接种量10%和含水率60%为中心点; Box-Behnken中心组合试验确定最佳发酵条件:棉花秸秆和玉米粉的比例为4. 4∶1,接种量8. 12%,含水率60%,发酵时间40 d,pH为4,此条件下羧甲基纤维素钠酶活最高,为310. 885 U/mL;比未优化条件下的酶活207. 496 U/mL提高了49. 8%。【结论】确定黑曲霉ZD利用棉花秸秆固体发酵产纤维素酶的最优条件,为利用该菌制备棉花秸秆发酵饲料,降解棉花秸秆纤维素含量,提供了理论依据和工艺参数。

摘要：【目的】研究以生物有机肥替代常规化肥对番茄生长及品质的影响,为化肥减施和提高番茄品质、稳定现有产量提供应用和理论基础。【方法】化肥常规用量减施30%、50%,根据不同减施比例配施生物有机肥,小区采用随机区组设计,土样及番茄果实采用随机取样法,测定减施化肥配施生物有机肥对土壤养分转化、及番茄果实营养品质、产量、发病率的影响。【结果】用生物有机肥代替化肥可增加土壤中速效N、P、K的含量,降低土壤pH值和电导率,与常规施肥处理相比,番茄果实总酸提高7.87%,VC含量提高24.95%,可溶性糖提高17.19%,产量与常规持平,差异不显著,番茄脐腐病发病率较常规施肥降低56.83%。【结论】在加工番茄种植中,用生物有机肥代替化肥的施肥方式可以降低化肥的施用量,有利于番茄果实的生长,品质提高,降低番茄脐腐病发病率。

摘要：【目的】检测磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因在大肠杆菌中能否高效表达。【方法】根据GenBank所公布的serC基因序列设计一对特异性引物,以*** JM109基因组为模板PCR扩增目的基因片段,将得到的目的基因定向克隆至大肠杆菌/黄色短杆菌穿梭表达载体pEC7中,构建重组表达载体并转化宿主菌***21(DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析。【结果】通过PCR扩增得到约1100 bp的DNA片段,经测序后分析该基因与已发表的serC基因具有99.27%的同源性;对重组表达载体进行酶切和PCR方法鉴定正确的命名为pEC7-C;重组表达载体转化宿主菌,SDS-PAGE分析可见约41 kD与理论大小一致的目标蛋白条带。【结论】重组表达载体转化后***21中蛋白表达量比原始菌株的蛋白表达量高,证明serC基因在*** BL21(DE3)中成功表达,为进一步构建L-丝氨酸高产基因工程菌奠定了基础。

摘要：【目的】以羧甲基纤维素钠酶活(Carboxymethylcellulose sodium enzyme activity,CMCase)和滤纸酶活(Filter paper enzyme activity,FPAase)作为双指标,通过响应面法对黑曲霉(Aspergillus niger)ZD产纤维素酶的液体发酵条件进行优化,研究黑曲霉对棉花秸秆的降解效果。【方法】通过单因素试验确定主要影响因素,通过Plackett-Burman和Box-Behnken设计进行因素优化和交互作用的影响,测定棉秆中纤维素含量。【结果】单因素试验确定碳源为淀粉,氮源为蛋白胨,无机盐为K_2HPO_4,培养时间168 h,转速150 r/min,温度30℃,接种量7%;利用Plackett-Burman设计筛选出影响产酶的显著因素是淀粉质量浓度、蛋白胨质量浓度、转速和接种量;最后通过Box-behnken确定产酶的最佳发酵条件,淀粉质量浓度1.21 g/100 mL,蛋白胨质量浓度0.25 g/100 mL,K_2HPO_4质量浓度0.1 g/100 mL,培养时间168 h,转速170 r/min,温度30℃,接种量7.8%,比初始发酵条件提高了35.96%。【结论】利用黑曲霉通过液体发酵降解棉秆效果显著,可以有效降解棉秆中纤维素和半纤维素,用真菌实现棉秆饲草化极具前景。

摘要：【目的】分析单因素试验和响应面法优化嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila-ALL)对葡萄灰霉菌抑菌活性的发酵条件,提高拮抗菌(ALL)对灰葡萄孢菌丝的抑制率,为Xenorhabdus nematophila-ALL菌株发酵生产及生物防治应用奠定基础。【方法】以菌丝抑制率为指标,经菌丝生长速率法,单因素试验及Box-Behnken设计对菌株发酵条件进行优化,确定菌株最佳发酵抑制条件。【结果】最佳培养条件为培养基初始pH值改为7.12,装液量为56%,发酵培养时间为77 h。经验证的抑制率为87.70%,比优化之前提高了1.82倍。【结论】发酵条件优化有效提高了嗜线虫致病杆菌对葡萄灰霉菌的抑菌活性。

摘要：主要探讨了T细胞免疫原TI对口蹄疫疫苗的免疫增强作用。设计并原核表达产生了一种包含口蹄疫病毒VP1,VP4,3A和3D蛋白上多个T细胞表位与两个通用T细胞表位的T细胞免疫原,命名为TI;同时表达了O和Asia 1两个型口蹄疫病毒VP1蛋白的串联编码基因,表达产物命名为OA-VP1。将上述T细胞免疫原分别与OA-VP1和口蹄疫灭活疫苗按不同剂量组合免疫小鼠,于免疫后不同时间测定各组小鼠的体液与细胞免疫应答情况。采用微量中和试验检测小鼠O型和Asia1型中和抗体,采用流式细胞检测技术和测定γ-干扰素的水平来分析不同免疫组小鼠细胞免疫的水平。结果显示,与灭活疫苗或OA-VP1单独免疫组相比,添加TI抗原后灭活疫苗(P<0.01)和OA-VP1免疫组(P<0.05)小鼠均能产生高水平的特异性中和抗体;且CD4+T细胞数量显著增多I,FN-γ产生水平显著升高(P<0.01)。说明TI抗原具有很好的诱导特异性体液与细胞免疫应答的作用,是一种很好的免疫增效剂,可作为口蹄疫蛋白亚单位疫苗和灭活疫苗中的一种有效成分,以提高疫苗的免疫效果。

摘要：根癌土壤农杆菌Ti质粒毒性区VirD1蛋白表现拓扑异构酶活性,能解除T-DNA边界处25bp重复序列的超螺旋状态,使外源基因的插入成为可能。本实验以C58菌株为模板,设计了一对含有BamHI和XhoI酶切位点的引物,成功克隆了VirD1基因,并构建了原核表达载体pET30a-VirD1,将其在宿主菌BL21中获得了表达,为将来构建含有VirD1基因的植物表达载体并协助目的基因转化奠定基础。